质粒 DNA 酶切及琼脂糖凝胶电泳分离鉴定组员：孙慜、孙苏、谢拓燕、郑倩倩、王佳玲【实验目的】1、了解 DNA 的限制性内切酶酶切的基本原理2、学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术【实验原理】DNA 的限制性内切酶酶切原理 （1）限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA，但不能切单链 DNA。它可分为三类:I 类和 III 类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP 的存在。III 类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而类酶在识别位点上切割 DNA 分子,然后从底物上解离。类由两种酶组成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶,它修饰同一识别序列。类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoR识别六个核苷酸序列:5- GAATTC-3), 有少数酶识别更长的序列或简并序列。类酶切割位点在识别序列中, 有的在对称轴处切割, 产生平末端的 DNA 片段(如 Sma:5-CCCGGG-3); 有的切割位点在对称轴一侧, 产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoR切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 DNA 限制性内切酶酶切图谱又称 DNA 的物理图谱，它由一系列位置确定的多种限制性内切酶酶切位点组成，以直线或环状图式表示。在 DNA 序列分析、基因组的功能图谱绘制、DNA的无性繁殖、基因文库的构建等工作中，建立限制性内切酶图谱都是不可缺少的环节，近年来发展起来的 RFLP(限制性片段长度多态性)技术更是建立在它的基础上。琼脂糖凝胶电泳条带的观察： （2）通过观察示踪染料的迁移距离可以判断 DNA 的迁移距离。溴酚蓝染料在琼脂糖凝胶的迁移速率大小与 300 和 4000bp 大小的双链 DNA 片断相同。当迁移足够距离后，就可以通过Gelview 染色来观察 DNA 片断。Gelview 是一种荧光染料。它可以在做胶时混入其中在电泳时进行染色，也可以待电泳完成后将凝胶浸泡在稀释的 Gelview 溶液中进行染色 。但必须将凝胶置于紫外透射仪中才可以对凝胶中的 DNA 或 RNA 进行观察。质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分离： （2）DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA 分子在高于等电点的pH 溶液环境中带负电荷，在电场中向正极移动，由于磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此它们能以相同的速度向正极移动。在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的构型和大小。具有不同分子质量或者不同构型的 DNA 分子泳动速率不一样，可以进行分离。未切割的质粒 DNA 在其泳道上也许会出现几个条带，之所以这样是由于质粒 DNA 在琼脂糖凝胶中的迁移距离是由其分子构象及其碱基对大小所决定的。质粒 DNA 以下列三种主要构象中的任何一种形式存在：1、 超螺旋 DNA：尽管质粒通常以开环的形式进行描述，然而在细菌细胞内 DNA 链即是盘绕在组蛋白周围形成一种致密的结构。这就是所谓超螺旋结构，由于其结构致密，它在凝胶中的泳动速度最快。2、 线性 DNA：当 DNA 损伤在 DNA 双链相对应的两条链上同时产生切口时，就会出现线性质粒 DNA，这种 DNA 的泳动速率介于超螺旋与切口质粒 DNA 之间。3、开环 DNA：在质粒 DNA 复制过程中，拓扑异构酶 I 会在 DNA 双螺旋中的一条链中引入一个切口，解开质粒的超螺旋。在质粒分离过程中由于物理剪切和酶的切割作用同样也会在超螺旋质粒中引入切口从而产生松散的开环结构。这种形式的质粒迁移速率最慢，其“松散”的分子形式阻碍了它在琼脂糖凝胶中的运动。【实验仪器和试剂】 （3）一、试剂1、EcoR酶解缓冲液（10）：1mol/L,pH=7.5 Tris-HCl;0.5mol/L NaCl;0.1mol/L MgCl 2。2、TEB 缓冲溶液（5）：称取 Tris 10.88g,硼酸 5.52g 和 EDTA-Na20.72g，用蒸馏水溶解后，定容至 200mL,即配成 89mmol/L Tris,89mmol/L 硼酸，2mmol/L EDTA pH=8.3(5)的TEB 缓冲溶液。使用时，用蒸馏水稀释 10 倍，称为 TEB 稀释缓冲溶液（0.5TBE ）3、样品缓冲溶液（10）：0.25%溴酚蓝，0.25%FF ，40%蔗糖水溶液（W/V ） （或用 30%甘油水溶液）4 菲啶溴红染色液5、EcoR酶6、琼脂糖7、DNA8、pBR322 质粒 DNA二、器材1 电泳仪 2 电泳槽模板 3 紫外灯 4 水平仪 5 玻璃板（10cm16cm）6 玻璃纸 7 锥形瓶（100mL）【操作步骤】 （3）一、质粒 DNA 的酶解将上一实验纯化的并经真空干燥的自制的 pBR322 质粒加 20L TE 缓冲溶液，使 DNA 完全溶解。二、琼脂糖凝胶电泳（1）琼脂糖凝胶的制备（2）胶板的制备（以上两步操作已由老师事先制备完成）（3）加样：取 10L 酶解液与约 15L 的溴酚蓝染色液混匀, 用微量移液枪小心加入样品槽中。注意上样时要小心操作, 在用微量移液枪吸取混合样品时不要含有气泡，可以放慢速度，在移液至样品槽中时，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。（4）电泳分离：接通电源，电压为 6080V,电流为 4050mA，当溴酚蓝移到距离胶板下约 12cm 处时，停止电泳。（5）观察：在波长为 254nm 的紫外灯下，观察染色后的电泳胶板。【注意事项】注意事项(1) 酶切时所加的 DNA 溶液体积不能太大，否则 DNA 溶液中其他成分会干扰酶反应。(2) 在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应注意防护。(3) 在用微量移液枪吸取混合样品时不要含有气泡，可以放慢速度。(4)在移液至样品槽中时，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。【实验结果】其中，第一、第七组结果可以。第 5 尚可。第 3 组失败，没有提取出 DNA。第 2、第 8组。提取效率很低。第 4、6DNA 有部分断裂。另，因 marker 的大小是 100,200,300,400,500,600bp。我们跑电泳时间偏长，marker条带已经跑出泳道看不见了。我们组为第四组，DNA 有部分断裂。【实验分析及讨论】实验误差分析我们组 DNA 有部分断裂的原因可能是：存在核酸酶污染或实验操作有问题。可能在实验过程中混有少量的蛋白质，或者在实验的提取过程中加入溶液混合所经历的时间过长，因为在碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒 DNA 样品混入了基因组 DNA。在实验中我们也发现纯化的并经真空干燥的自制的 pBR322 质粒呈现白色块状（应为无色透明状）如下图所示，所以有可能已混入杂质。讨论1、什么是质粒？答：质粒是细菌细胞内一种自我复制的环状双链 DNA 分子，能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组 DNA 技术中重要的工具。2、什么是 DNA 的变性和复性？ （4）DNA 的变性是指：DNA 分子内部的双螺旋结构被破坏，解链为单链，DNA 将失去原有的空间结构，虽然此时不伴有共价键的断裂，但其空间结构的改变，将造成核酸的理化性质与生物学功能也随之改变，这种现象称为变性。DNA 的复性是指：DNA 的变性是可以可逆的。当热变性后，温度缓缓下降，被解开的两条链又可重新互补结合，恢复成原来完整的 DNA 双螺旋结构分子。这一过程称为复性或退火。3、提取质粒所用的酚：氯仿，异戊醇的比值是多少提取质粒所用的酚：氯仿，异戊醇的比值是 25:24:1在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1，同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。参考文献（1） 摘自仪器仪表之家资料库 http:/www.1718baba.com/jishu/16829.htm（2） 百度文库 http:/wenku.baidu.com/view/7d35e842be1e650e52ea993f.html（3） 生物化学与分子生物学实验技术 主编：厉朝龙 浙江大学出版社（4） 生物化学复习纲要和练习 主编：厉朝龙