猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 4848 的鉴定及表达 梁盼红 刘光学 毛立 张少华 王莉杰 王立群 骆学农 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室 摘 要： 为鉴定并表达猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 (TsSerpin) , 提取猪囊尾蚴总RNA, 设计引物并通过 RT-PCR 技术扩增 TsSerpin4848 基因, 将纯化的 PCR 产物连接到 p MD19-T 载体后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞, 筛选阳性克隆并测序, 并用生物信息学方法分析其序列和结构特征。构建 p ET-30a (+) -4848 重组表达载体, 经酶切鉴定及测序验证后转入大肠杆菌 BL21 (DE3) 中进行诱导表达, 目的蛋白纯化后进行 SDSPAGE 和 Western-blot 分析。结果表明, TsSerpin4848的开放阅读框由 1 065 个核苷酸组成, 编码 355 个氨基酸残基, 其理论分子质量约为 39 ku。TsSerpin4848 含有 serpin 家族保守序列 DEEGAE 和FIVDHPFLFFI, 并含有 serpin 特有的反应中心环结构域, 其三级结构中有 8 个 螺旋和 3 个 折叠;重组 TsSerpin4848 蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在, 可被猪囊尾蚴阳性血清识别, 表明 TsSerpin4848 蛋白具有良好的反应原性, 有望作为猪囊虫病诊断的候选抗原。关键词： 猪带绦虫; 丝氨酸蛋白酶抑制剂; 鉴定; 表达; 候选抗原; 作者简介：梁盼红 (1991-) , 女, 甘肃兰州人, 硕士生, 研究方向为寄生虫分子生物学与免疫学。作者简介：骆学农, 研究员, 博士生导师, 主要从事人兽共患病与兽医公共卫生研究, Tel:0931-8342716, E-mail:luoxuenongcaas.cn收稿日期：2017-06-06基金：国家重点研发计划项目 (2017YFD0501303) Identification and expression of Taenia solium serine protease inhibitor 4848LIANG Pan-hong LIU Guang-xue MAO Li ZHANG Shao-hua WANG Li-jie WANG Li-qun LUO Xue-nong Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences; Abstract： To identify and express the serine protease inhibitor of Taenia solium (TsSerpin) , the total RNA was extracted from T.solium metacestodes.Specific primers were designed and used to amplify TsSerpin4848 by RT-PCR.PCR products were ligated into the p MD19-T vector.After being transformed into Escherichia coli DH5, the positive clones were identified and confirmed by sequencing.The sequence of TsSerpin4848 was analyzed with the bioinformatics software.The recombinant p ET-30 a (+) -4848 plasmid was constructed and transformed into E.coli BL21 (DE3) .The target protein was expressed, purified and analyzed by SDS-PAGE and Western-blot.In result, TsSerpin4848 c DNA sequence contained an open reading frame of 1 065 nucleotides, and the deduced protein consisted of 355 amino acids with the theoretical protein molecular weight of 39 ku.TsSerpin4848 had a serpin conserved structure domain with the DEEGAE and FIVDHPFLFFI, and a specific reactive centre loop (RCL) motif.Analysis of tertiary structure of TsSerpin-4848 revealed that it had eight -helices and three -sheets.The expressed products of TsSerpin4848, existed in inclusion bodies, could be recognized by the positive serum from the pig infected with T.solium by immunoblotting, indicating that the protein TsSerpin4848 has a good immunogenicity and it is hopeful to be a diagnostic antigen for cysticercosis.Keyword： Taenia solium; serine protease inhibitor; identification; expression; candidate antigen; Received： 2017-06-06猪囊虫是猪带绦虫 (Taenia solium) 的幼虫, 主要寄生于猪或人的肌肉及脑组织, 可引起人畜共患的猪囊虫病 (cysticercosis) 。猪囊虫病呈世界性分布, 但主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲。我国每年因猪囊虫感染而废弃的猪肉所造成的经济损失高达 1.21 亿美元1。因此, 猪囊虫病不仅对畜牧业造成较大的经济损失, 也严重威胁着人体健康及公共卫生安全2。目前研究表明, 寄生性蠕虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serine protease inhibitor, 简称 Serpin) 可通过抑制宿主丝氨酸蛋白水解酶的活性, 从而使寄生性蠕虫免受宿主蛋白水解酶的降解, 逃避宿主的防御机制, 有利于寄生性蠕虫的入侵、存活及在宿主体内的定植3。因此, Serpin 在宿主与寄生性蠕虫的相互作用中起重要作用。Serpin 是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一类, 由 40 多个来源不同的成员组成, 其中大多数的成员都是单链糖蛋白, 分子质量为 40100 ku。Serpin 广泛存在于寄生性蠕虫、高等动物、昆虫以及植物和病毒中4-6, 参与许多基本的生理学反应, 如血液凝固、 (血) 纤维蛋白溶解、炎症、补体激活、信号级联放大、免疫应答和肿瘤抑制等7-9。目前研究显示, 线虫、吸虫和绦虫均有 Serpin 存在, 而且大多可分泌到虫体外, 易被宿主的免疫系统识别, 从而引起宿主的免疫应答。Ghendler 等10从曼氏血吸虫成虫中鉴定了丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 Smpi56, 其编码蛋白可抑制弹性蛋白酶的活性。L-im 等11发现, Serpin 可使感染血吸虫的小鼠获得 80%的减虫率和 92%的减卵率。Merckelbach 等12发现, 原核表达的多房棘球蚴Serpin 能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶及弹性蛋白酶的活性, 推测多房棘球绦虫能抵抗宿主肠道消化酶对虫体的损伤, 以此逃避宿主的免疫攻击。因此, 笔者推测 Ts Serpin 也具有与棘球蚴 Serpin 类似的功能, 有望成为重要药物靶标或有潜力的疫苗与诊断候选抗原, 用于猪带绦虫和囊尾蚴病的综合防控。本研究拟对猪带绦虫丝氨酸蛋白酶家族成员之一的 Ts Serpin4848 进行克隆、序列特征分析和蛋白表达, 探索其作为猪囊虫病诊断抗原的可行性, 为研制猪囊虫病新型诊断技术奠定基础。1 材料与方法1.1 虫体、血清与试剂猪囊尾蚴、猪囊尾蚴阳性血清与阴性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病课题组保存。TRIzol 试剂、反转录试剂盒 (Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit) 、质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、p MD19-T 载体、限制性内切酶 Bam H和 Hind、T4 DNA 连接酶均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。Prestained Protein Ladder 购自美国 Thermo 公司。p ET-30a (+) 、大肠杆菌 DH5 和 BL21 (DE3) 感受态细胞、异丙基-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 、X-gal、5蛋白上样缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记的家兔抗猪 Ig G (HRP-Ig G) 购自美国 Sigma 公司。Ni Seph arose 6 Fast Flow 蛋白纯化试剂盒购自美国 GE 公司。1.2 目的基因的克隆和生物信息学分析从猪带绦虫基因组数据库 (http:/192.168.51.199) 中搜索 Serpin 同源基因, 将其中之一命名为 TsSerpin4848。根据 Ts Serpin4848 的核苷酸序列, 利用Primer Premier 5.0 软件设计其特异性引物 (Ts Serpin4848-F:5-CGCGGA TC CA TGTC CC CA CTGA GC-ATA-3, 下划线处为 Bam H酶切位点;TsSerpin4848-R:5-CCCAAGCTTGGTACTTGCTTTC CGG-TTC-3, 下划线处为Hind酶切位点) 。用 TRIzol 抽提猪囊尾蚴总 RNA, 利用 Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit 提供的 Oligo (d T) 和反转录酶 (Prime ScriptRTase) 合成 c DNA 第一链, 进而用 Ts Serpin4848 的特异性引物进行PCR 扩增。纯化的 PCR 产物与 p MD19-T 载体连接, 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。将经菌液 PCR 鉴定为阳性的克隆送江苏金唯智生物技术有限公司测序验证。应用在线软件 Prot Param (http:/web.expasy.org/prot param/) 预测蛋白质的理论分子质量、理论等电点、氨基酸组成等。利用在线软件 Prot Scale (http:/web.expasy.org/protscale/) 及 Hphob./Kyte&Doolittle 方法分析蛋白质的亲疏水性。应用软件 Signal P 4.1Server (http:/www.cbs.dtu.dk/services/Signal P/) 对 Ts Serpin 4848 蛋白的信号肽进行预测。应用软件 TMHMMServer v.2.0 (h