氯丁二烯在生物体代谢机制研究现状 王超洋 秦文华 王平 河南省职业病防治研究院 摘 要： 氯丁二烯主要应用于氯丁橡胶的生产, 职业接触是主要的暴露途径, 可以通过吸入和皮肤吸收进入体内。氯丁二烯在细胞色素 P450 作用下, 氧化代谢为环氧化物, 该类环氧化物有致癌性, 并通过进一步水解和 GSH 加合作用, 生成一系列水溶性的和易排出的水解化合物和 GSH 加合物。本文主要综述了有关氯丁二烯代谢的研究, 识别其主要代谢产物, 为进一步研究职业接触氯丁二烯生物标志物奠定基础。关键词： 氯丁二烯; 代谢物; 肝微粒体; 作者简介：秦文华, E-mail:qwh6668163.com收稿日期：2017-06-20基金：国家重点临床专科建设科研项目 (财社2011170 号) Received： 2017-06-202-氯-1, 3-丁二烯 (以下简称氯丁二烯) 是应用于氯丁橡胶生产的主要化工原料, 氯丁橡胶是一种耐腐蚀性人造橡胶, 用于汽车零部件、电线电缆外壳、黏合剂和个体防护装备等1。氯丁二烯没有已知的环境和饮食来源, 职业接触是主要的暴露源, 主要通是过吸入和皮肤吸收途径进入人体, 常发生于单体合成、运输和聚合过程中2。为了了解对人类健康可能产生的不利影响, 在动物实验方面已经做出了广泛的评估。文献报道已经描述了其急性、亚急性和慢性毒性3-7。在暴露于氯丁二烯的工人中, 其患肺癌和肝癌的风险增大, 但流行病学研究结果还未确定其对人体的致癌性8-11。大鼠和小鼠通过吸入方式暴露于氯丁二烯中, 研究表明, 氯丁二烯对这两个物种具有致癌性12-13。基于在动物实验中其致癌性有充足证据, 对人体致癌性的证据不足, 国际癌症研究机构把氯丁二烯列为 2B 类致癌物 (可能致癌物) 14。国内有关氯丁二烯的研究主要集中于氯丁二烯的毒理及临床救治, 而有关氯丁二烯的代谢方面的研究国内还尚未见到报道, 在国外近几年, Tony Munter、Lisa Cottrell、Bernard T.Golding、William P.Watson、Rikas Ghai 等人对氯丁二烯的代谢机制进行了比较全面的研究。本文主要回顾了国外有关氯丁二烯代谢产物及代谢机制的研究现状。对职业接触氯丁二烯生物标志物研究有重要意义。1 氯丁二烯的氧化代谢肝脏和肺这些组织更易诱发肿瘤, 并代表了对外源性化学物质代谢的重要组织。早在 1979 年, H.Bartsch 等15人就认为, 小鼠肝微粒体对氯丁二烯作用可能有环氧化物形成, 并认为该代谢物可能会有毒性和致突变性。在雄性小鼠体内产生肺肿瘤的最低氯丁二烯浓度为 12.8 ppm, 相比之下丁二烯最低浓度为 62.5 ppm6, 可知, 氯丁二烯比丁二烯有更强的致癌性。在 2001 年, M.V.Himmelstein 等16人研究认为, 1-氯乙烯基环氧乙烷是在大鼠肝微粒体内氯丁二烯的代谢产物, 并表明, 这种环氧化物是诱导有机体畸变的物质。对来自 SD 大鼠、Fischer 344 大鼠、B6C3F1 小鼠和人的肝微粒体中氯丁二烯的代谢作用进行了全面地研究。在细胞色素 P450 作用下, 氯丁二烯被代谢为 1-氯乙烯基环氧乙烷和 2-氯-2-乙烯基环氧乙烷, 并且确认这两种环氧化物均有 R型和 S 型两种对映异构体, 除了环氧化物外, 还有多种多功能醛和酮类物质形成3。无论性别, 对于人或龋齿类动物, 1-氯乙烯基环氧乙烷是氯丁二烯氧化代谢的主要产物。在没有环氧化物水解酶存在情况下, 其主要代谢物 1-氯乙烯基环氧乙烷被认为是稳定的。1-氯乙烯基环氧乙烷的稳定性与来自乙烯的环氧乙烷、来自丁二烯的环氧树脂、或来自异戊二烯的异戊二烯单环氧化物的稳定性是一致的17-20。不同物种间, 氯丁二烯通过肝脏微粒体代谢相似, 其固有清除率显示, 小鼠比人的最大相差大约 2 倍数多21-22。对于氯丁二烯在肝微粒体中的氧化速率, 该结果与目前的研究一致:小鼠大鼠人23。比起已报道的有关丁二烯氧化为环氧丁烯的 Vmax/Km 值, 微粒体中氯丁二烯氧化的 Vmax/Km 值显示较大24。氯丁二烯和丁二烯的 Vmax/Km 值的不同这一现象与丁二烯对肺肿瘤有相对更大的功效这一现象一致21-22。人体、大鼠、小鼠系统对氧化代谢产物 1-氯乙烯基环氧乙烷的两种异构体 R 型与 S 型的生成比率有明显差异3。氯丁二烯的氧化代谢作用不同于异戊二烯25-26和丁二烯27-28, 这两种物质除了生成单环氧化物外还生成双环氧化物。在肝微粒体中, 与大鼠、仓鼠、或人相比, 对于小鼠, 氯丁二烯存在的更快的氧化速率与更多的 1-氯乙烯基环氧乙烷生成量。低浓度氯丁二烯的氧化时, 1-氯乙烯基环氧乙烷在大鼠和仓鼠肺微粒体中仍然能够被定量检测到21-22。图 1 氯丁二烯代谢途径 (a 和 b 分别代表 R 和 S 对映异构体) 下载原图2 环氧化物的水解及其进一步代谢作用氯丁二烯在细胞色素 P450 作用下氧化代谢生成两种单环的环氧化物, 分别是2-氯-2-乙烯基环氧乙烷和 1-氯乙烯基环氧乙烷。在缺少谷胱甘肽 (以下简称GSH) 转移酶的情况下, 在微粒体孵育体系中, 进一步代谢物不能很快与 GSH 反应, 首先水解酶促其进行水解。因此水解酶作用下的 1-氯乙烯基环氧乙烷的水解对生物体毒理和解毒是特别重要的。在肝和其它动物组织中, 环氧化物水解酶促使环氧化物水解, 生成水溶性和易排出的邻二醇类化合物29-30。这与Tony Munter 等人31的研究一致, 1-氯乙烯基环氧乙烷, 优先水解生成 3-氯-3-烯-1, 2, -丁二醇 (19a/19b) 。为确认 1-氯乙烯基环氧乙烷在小鼠肝微粒体内的潜在氧化代谢物, Matthew W 等人21-22进行实验, 结果显示有 1-氯乙烯基环氧乙烷的二醇类代谢物 3-氯-3-烯-1, 2-丁二醇生成。对于每一种浓度的氯丁二烯, 与大鼠或人肝脏微粒体比较, 小鼠肝脏微粒体中能检测到更多的3-氯-3-烯-1, 2-丁二醇23。通过环氧化物水解酶作用促使水解发生, 对 (S) 型 1-氯乙烯基环氧乙烷是有选择性的, 从而导致 (R) 型 1-氯乙烯基环氧乙烷的累积, 对氯丁二烯引起小鼠肿瘤的方面更敏感32。在肝微粒体中, 1-氯乙烯基环氧乙烷水解的Vmax/Km 值表明, 小鼠比大鼠大约慢 2 倍多, 比仓鼠或人大约慢 6 倍21-22。在小鼠肝微粒体中通过氧化作用的 1-氯乙烯基环氧乙烷的固有清除率比氯丁二烯的氧化清除率低大约 10 倍。还不确定在小鼠肺中是否有 1-氯乙烯基环氧乙烷氧化代谢的发生21-22。代谢物 2-氯-2-乙烯基环氧乙烷在微粒体中迅速被水解为 1-羟基-3-烯-2-丁酮 (4) 。但不能区分是通过环氧化物水解酶水解还是自发水解。对于环氧化物 2-氯-2-乙烯基环氧乙烷, 还有一些次要代谢物, 这些代谢物通过其它途径生成, 分别是 1-氯-3-烯-2-丁酮 (5) 、2-氯-3-烯-1-丁醛 (6) 和 (Z) -2-氯-2-烯-1-丁醛 (7) 。5 和 6 混合物, 是通过 2-氯-2-乙烯基环氧乙烷的重排, 或在细胞色素 P450 作用下氯丁二烯的直接氧化, 而形成的。 (Z) -2-氯-2-烯-1-丁醛 (7) 是通过热力学不稳定的 2-氯-3-烯-1-丁醛 (6) 异构化而形成31。代谢物 1-羟基-2-丁酮 (8) 、1-氯-2-丁酮 (9) 、1-氯-2-羟基-3-丁烯 (10) 和 2-氯-1 丁醛 (11) , 也随着进一步代谢产物的形成而产生31。3 代谢物与 GSH 的加合3.1 2-氯-2-乙烯基环氧乙烷代谢物与 GSH 的加合高活性的亲电代谢产物可能与 GSH 进行加合反应, 该反应是一种重要的细胞防御机制, 它可以生成水溶性的、不活泼的加合物, 更容易排出体外29。亲电子物质与 GSH 的加合反应能够自发或通过 GSH 转移酶催化而发生。在 19 世纪80 年代, Summer 和 Greim 等人33研究了, 氯丁二烯在大鼠中的代谢作用和解毒。他们发现, 氯丁二烯会导致肝脏 GSH 的明显消耗和 GSH 加合物的形成。研究结果显示, 即使在不存在 GSH 转移酶的条件下, 代谢物 1-羟基-3-烯-2-丁酮 (4) 、1-氯-3-烯-2-丁酮 (5) 、和 (Z) -2-氯-2-烯-1-丁醛 (7) 也能迅速与GSH 加合31。为了对氯丁二烯解毒进行定性和定量研究, 氯丁二烯代谢物与GSH 的反应在磷酸盐缓冲溶液 (PH7.4) 中进行, 其 GSH 加合物被确认为是 1-羟基-4- (S-谷胱甘肽) -2-丁酮 (14) 、1, 4-双- (S-谷胱甘肽) -2-丁酮 (15) 和 (Z) -2- (S-谷胱甘肽) -2-烯-1-丁醛 (16) 23。加合物 (Z) -2- (S-谷胱甘肽) -2-烯-1-丁醛 (16) 的形成, 是通过 C-2 上氯原子被硫取代完成的34。首先, 多种 、 位不饱和的羰基化合物通过迈克尔加成反应与 GSH 和 GSH 的中间产物反应35-36, 这些中间产物是 1, 2-二溴磷化-3-氯丙烷和 1, 2-二溴乙烷的生物转化而来37-38。其形成机制可能是通过巯基向双键上的 -碳迈克尔加成反应完成的, 接着是一个分子攻击硫, 并且氯所在的碳位移形成中间物, 这些可以被氯化物捕获而形成 3-氯-2-谷胱甘肽丁醛, 它们能经过去除氯原子而形成 (Z) -2- (S-谷胱甘肽) -2-烯-1-丁醛 (16) 。加合物 1-羟基-4- (S-谷胱甘肽) -2-丁酮 (14) 的识别, 是通过LC/MS 分析, 等量的 GSH 与 1-羟基-3-烯-2-丁酮 (4) 的反应, 混合物中显示有一种主要的加合物 1-羟基-4- (S-谷胱甘肽) -2-丁酮 (14) 形成。质谱显示的基本特征与先前 Krause et al 等人报道的该物质的特征一致39。加合物 1, 4-双- (S-谷胱甘肽) -2-丁酮 (15) 的形成, 是过量的 5 与 GSH 加合反应, 形成的主要加合产物是 1-氯-4- (S-谷胱甘肽基) -2-丁酮 (18) , 该反应时通过GSH 与 5 的双键的迈克尔加成反应完成的, 通过质谱分析, 其副产物是双 GSH加合物 1, 4-双合-S 谷胱甘肽基-2-丁酮 (15) 。而当过量的 GSH 与 5 加合反应时, 其主要反应产物主要是 1, 4-双合-S 谷胱甘肽基-2-丁酮 (15) 。3.2 1-氯乙烯基环氧乙烷代谢物与 GSH 的加合1-氯乙烯基环氧乙烷与 GSH 反应生成三种加合物。两种主要的加合物被确认是2-氯-3-羟基-4- (s-谷胱甘肽) -丁烯 (17) 的一对非对映异构体。通过 C 核磁共振和大量光谱数据分析, 少数加合物认为是 2-氯-4-羟基-3- (s-谷胱甘肽) -丁烯23。1-氯乙烯基环氧乙烷与 GSH 的加合用带有速率常数的伪二阶反应机制模型来描述, 对于肝微粒体, 其速率大小顺序为仓鼠Fischer 大鼠Wistar大鼠小鼠人;仓鼠与人之间的差别大约相差 8 倍21-22。1-氯乙烯基环氧乙烷和 GSH 自发的一阶反应的半衰期大约是 10 h, 比环氧丙烷与 GSH 的半衰期1.7h 要长40。1-氯乙烯基环氧乙烷与 GSH 的酶促加合被认为是一个标准的饱和米凯利斯-门顿反应41。在肝微粒体中, GSH 加合物形成总量的顺序是小鼠大鼠人, 反映出通过小鼠肝脏微粒体系统形成的活性代谢物量比较大。4 代谢物与核苷和 DNA 的反应氯丁二烯被细胞色素 P450 代谢为亲电代谢物, 这些物质容易受到 DNA 碱基的亲核基团的攻击29。在 37