分子标记技术简介分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是 DNA水平遗传多态性的直接的反映。与其他几种遗传标记形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA 分子标记具有的优越性有：大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的 DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自 DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在 DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。分子标记的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的 DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性 DNA片段。理想的分子标记必须达以下几个要求：(1) 具有高的多态性；(2) 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型；(3) 能明确辨别等位基因；(4) 遍布整个基因组；(5) 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个基因组；(6) 选择中性(即无基因多效性)；(7) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化)；(8) 开发成本和使用成本尽量低廉；(9) 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有要求。【分子标记的种类】一、基于分子杂交技术的分子标记技术此类标记技术是利用限制性内切酶解及凝胶电泳分离不同的生物 DNA 分子，然后用经标记的特异 DNA 探针与之进行杂交，通过放射自显影或非同位素显色技术来揭示 DNA 的多态性。限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)1974 年 Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(RFLP)技术，它是一种以 DNADNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP 基本原理：利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组 DNA，得到大小不等的 DNA片段，所产生的 DNA数目和各个片段的长度反映了 DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段，就形成不同带，然后与克隆 DNA探针进行 Southern杂交和放射显影，即获得反映个体特异性的 RFLP图谱。它所代表的是基因组 DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变从而造成基因型间限制性片段长度的差异。RFLP 的等位基因其有共显性特点。RFLP 标记位点数量不受限制，通常可检测到的基因座位数为 14个。RFLP 技术也存在一些缺陷，主要是克隆可表现基因组 DNA多态性的探针较为困难；另外，实验操作较繁锁，检测周期长，成本费用也很高。自 RFLP问世以来，已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛的应用。数目可变串联重复多态性(Variable Number of Tandem Repeats，VNTR )数目可变串联重复序列又称小卫星 DNA (Minisatellite DNA)，是一种重复 DNA小序列，为 10到几百核苷酸，拷贝数 10一 10001不等。VNTR基本原理与 RFLP大致相同，只是对限制性内切酶和 DNA探针有特殊要求：(1)限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中，以保证小卫星或微卫星序列的完整性。(2)内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点，则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列，通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。(3)分子杂交所用 DNA探针核昔酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列，通过分子杂交和放射自显影后，就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点，得到个体特异性的 DNA指纹图谱。小卫星标记的多态信息含量较高，在 17一 19之间。缺点是数量有限，而且在基因组上分布不均匀，这就极大限制其在基因定位中的应用。VNTR也存在实验操作繁琐、检测时间长、成本高的缺点。二、基于 PCR技术的分子标记技术（一）、随机引物的 PCR标记所用引物的核苷酸序列是随机的，其扩增的 DNA 区域事先未知。随机引物 PCR扩增的 DNA 区段产生多态性的分子基础是模板 DNA 扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变，不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物 PCR标记表现为显性或共显性。随机扩增多态性 DNA (Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD )RAPD 技术是 1990年由 Wiliam和 Welsh等人利用 PCR技术发展的检测 DNA多态性的方法。基本原理：它是利用随机引物（一般为 810bp）通过 PCR反应非定点扩增 DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物 DNA片段的多态性。扩增片段多态性便反映了基因组相应区域的 DNA多态性。RAPD 所使用的引物各不相同，但对任一特定引物，它在基因组DNA序列上有其特定的结合位点，一旦基因组在这些区域发生 DAN片段插人、缺失或碱基突变，就可能导致这些特定结合位点的分布发生变化，从而导致扩增产物数量和大小发生改变，表现出多态性。就单一引物而言，其只能检测基因组特定区域 DNA多态性，但利用一系列引物则可使检测区域扩大到整个基因组，因此，RAPD 可用于对整个基因组 DNA进行多态性检测，也可用于构建基因组指纹图谱。与 RFLP相比，RAPD 具有以下优点：(1)技术简单，检测速度快；(2) RAPD分析只需少量 DNA样品；(3)不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用于不同生物基因组分析；(4)成本较低。但 RAPD也存在一些缺点：(1) RAPD 标记是一个显性标记，不能鉴别杂合子和纯合子；(2)存在共迁移问题，凝胶电泳只能分开不同长度 DNA片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的 DNA片段；(3) RAPD 技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。任意引物 PCR (Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction， APPCR)在 APPCR分析中，所使用的引物较长(1050 bp) ， PCR 反应分为两个阶段，首先寡核昔酸引物在低严谨条件下与模板 DNA退火，此时发生了一些合成，以便稳定模板与引物之间相互作用。然后进行高严谨退火条件的循环，两个位点间那些序列在低严谨度退火条件下发生的引物延伸可继续在高严谨条件下扩增。采用变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分析PCR产物，最终反应结果与 RAPD类似。只要设计的引物在低严谨退火条件下能减少引物产生人为产物，应用成对组合的引物可以产生新的 APPC R谱带，但引物配对组合使用时，得到的图谱与单引物单独使用时产生的图谱之和很不相同，这样，50 个引物能产生 1250种不同指纹图谱。APPCR 方法不需预知序列资料，而且检测的基因组样本是任意的，还能够用于检测近等基因系(或同类系)中的多态性。APPCR 的缺点是每个新的多态性都必须经纯化才能进一步使用。另外，此方法在杂合体中仅可辨别长度多态性。DNA 扩增指纹印迹(DNA Amplification Fingerprinting，DAF)DAF 是一种改进的 RAPD分析技术，与 RAPD技术不同的是，DAF 分析中所使用的引物浓度更高，长度更短(一般为 5一 8 bp)，因此它所提供的谱带信息比 RAPD大得多，如当使用 5个核昔酸的引物时，引物和模板的组合大约可扩增出 10一 100个 DNA片段。PCR 扩增产物是在凝胶上进行分离，通过银染即可产生非常复杂带型。（二）、特异引物的 PCR标记特异引物的 PCR标记所用引物是针对已知序列的 DNA 区段而设计的，具有特定核苷酸序列（通常为 1824 bp），可在常规 PCR复性温度下进行扩增，对基因组 DNA 的特定区域进行多态性分析。序列标志位点(Sequence Tagged Sites，STS)STS 是对以特定对引物序进行 PCR特异扩增的一类分子标记的统称。通过设计特定的引物，使其与基因组 DNA序列中特定结合位点结合，从而可用来扩增基因组中特定区域，分析其多态性。利用特异 PCR技术的最大优点是它产生信息非常可靠，而不像 RFLP和 RAPD那样存在某种模糊性。简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)简单重复序(SSR)也称 微卫星 DNA，其串联重复的核心序列为 1一 6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n 和(TG) n 每个微卫星 DNA的核心序列结构相同，重复单位数目 10一 60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR 标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过 PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用 PCR的方法扩增出不同长度的 PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR 具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用 SSR技术分析微卫星 DNA多态性时必须知道重复序列两端的 DNA序列的信息。如不能直接从 DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。序列特异性扩增区(Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR)SCAR 标记是在 RAPD技术基础上发展起来的。SCAR 标记是将目标 RAPD 片段进行克隆并对其末端测序，根据 RAPD 片段两端序列设计特异引物，对基因 DNA 片段再进行 PCR特异扩增，把与原 RAPD片段相对应的单一位点鉴别出来。SCAR 标记是共显性遗传，待检 DNA 间的差异可直接通过有无扩增产物来显示。SCAR 标记方便、快捷、可靠，可以快速检测大量个体，结果稳定性好，重现性高。单引物扩增反应(Single Primer Amplificatipn Reawtion，SPAR)SPAR 技术是与 RAPD技术相似的一种标记技术，SPAR 也只用一个引物，但所用的引物是在 SSR的基础上设计的。这些引物能与 SSR之间的间隔序列进行特异性结合，然后通过 P(：R 技术扩增 SSR之间的 DNA序列，凝胶电泳分离扩增产物，分析其多态性。另外，还有一种与 SPAR技术非常相似的标记技术，即 ISTR ( Inverse Sequencetagged Repeat)技术，ISTR 所用的引物是在反向重复序列基础上设计的，PCR 扩增的是反向重复序列之间的 DIVA序列。DNA 单链构象多态性(Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP)SSCP 是指等长的单链 DNA因核昔酸序列的差异而产生构象变异，在非变性聚丙烯酞胺中的表现为电泳迁移率的差别。单链 DNA构象分析对DNA序列的改变非常敏感，常常一个碱基差别都能显示出来。在 SSCP分析中，利用 PCR技术定点扩增基因组 DNA中某一目的片段，将扩增产物进行变性处理，双链 DNA分开成单链，再用非变性聚丙烯酞胺凝胶电泳分离，根据条带位置变化来判断目的片段中是否存在突变。SSCP 结果判定是通过多个样品之间对比，观察条带之间位置改变，从而显示出不同生物个体的 DNA特异性，达到指纹分析目的。为了进一步提高 SSCP的检出率，可将 SSCP分析与其它突变检测方法相结合。其中与杂交双链分析(Heterocluplex analys