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电镜技术及应用 B Negative Stain EM Immuno-EM CryoEM Correlative Light-Electron Microscopy Symmetry Single Particles Data Processing AutomationMacromolecular Imaging ADDING CONTRAST (with heavy metals) negative stain immuno-labeling USING INTRINSIC CONTRAST particles in thin film of vitrified iceNegative StainA sample deposited on a carbon coated gridand surrounded by stain (light gray shading)interacting with an electron beam (arrows).Phosphotungstateuranyl actetate/formatemolybdate (ammonium)Benefits:Very high contrast.Radiation damage causes less change in the stain area.The sample is easy to prepare.Drawbacks:The particle is distorted during the staining process.Artifacts can arise if the stain is uneven.The resolution is limited to approximately 20.Negative stainingTypical transmission electronmicrograph of negatively stained,purified virus preparation calicivirus免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。主要分为两大类:一类是免疫凝集电镜技术,即采用抗原抗体凝集反应后,再经负染色直接在电镜下观察;另一类则是免疫电镜定位技术。该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合,在电子显微镜下观察,由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。免疫电镜的应用,使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。Immuno-EMImmuno-labeling using immunogold labels to localize epitopes widely used in cell biologymacromoleculeAu sphereMAbepitopeEpitope localization in an engineered vaccine a new vaccine for Hepatitis B contains 3 antigens, S, S1 & S2,with epitopes on each does every particle contain all 3 of these epitopes ? MAbs against S, S1 & S2 have been made & conjugated withgold:S 15 nmS1 10 nmS2 5 nmImmunolabelling of one epitope (S1) using 10 nm-Au labelled MAbTriple labelling of 3 epitopes on one single particleCryo-EM Negative stain Easy to prepare Good contrast Preservation Sample distortion Resolution limited to about 20 angstroms Cryo Difficult sample prep Low contrast Best preservation and therefore resolutionCryo prep using holey filmFlash freeze in liquid ethaneVitrobotData collectionImage recordingFilm High density content (20k x 16k pixels) Slow (development time, drying) Requires digitization (scanning takes hours)CCD (charge-coupled device) Low density content (4k x 4k pixels) Fast (ms to sec)CMOS (Complementary metaloxidesemiconductor) Fast High noise immunityCryoEM 冷冻(低温):样品经快速冷冻后,结构以接近天然状态保存 成像:电子穿过样品后的成像深浅与样品自身的电子密度分布相关 三维重构:综合样品在不同角度的成像CryoEM 尽管利用重金属对蛋白质样品进行负染可以提高对比度便于观察, 但同时也引入了样品失水以及变形扭曲的问题, 降低了成像真实度和可信度. 蛋白质溶液可以在极短的时间内被迅速冷冻. 这一过程中分子内部和表面的水分子直接相变为玻璃态透明物质, 避免了缓慢降温过程中由于固态冰的形成而对生物分子造成破坏. 这样就能够很好地维持分子结构. 冰冻样品需要在液氮或液氦温度左右真空状态中进行观测. 冰冻状态使得由于电子束轰击而造成的样品损坏降至最低. 冰冻技术的引入使得蛋白质的微观结构在整个操作过程中得到很好维护. 电镜高分辨率成像也因而成为可能. 电镜高分辨率成像结果已经被证明与X射线晶体结构基本吻合, 其数据可靠性已得到验证.冷冻电镜手段的优点 不需要晶体(二维晶体除外) 也不需要特别的纯化(只要计算机能够通过大小、形状和对称性等进行分辨) 可用于蛋白质天然功能状态的研究(在成晶体条件下, 蛋白质未必处功能状态) 可用于各种中间态的研究 适合大分子聚合体、细胞和亚细胞水平的结构研究CryoEM和X射线晶体学的互补性 电镜提供低分辨率的整体结构 X射线晶体学提供高分辨率的局域结构 在不能获得整体的晶体结构时,通过EM Density MapFitting可以获得分子相互作用的模型 Homology Modeling 电镜三维结构还可提供低分辨率的相位模型,结合晶体衍射的强度数据,可解得高分辨率的结构CryoEM Map of SMSV as PhaseModelJ Struct Biol. (2003) 141: 143148.cryoEM reconstruction at 19 resolution X-ray structure at 3.2 resolutionPhase ExtensionPNAS. (2006). 103, 8048-8053.冰冻电镜和三维重构的流程Freezing TransferLiquid ethane ImagingSampleAnalysis 3D reconstructionHoley gridFrom Two-Dimensional Projections toThree-Dimensional Reconstructions样品不具规则排列时的两种三维重构方法中心截面原理(central-slice theorem): The Fourier transform of a 2D projectionof any 3D object is equal to a central slice of the 3D Fourier transform of thisobject, the slice having the same orientation as the projection). 根据大量分子无规则取向时的投影图象. 分子在溶液中是任意取向的. 这一趋势在冰冻过程中一般会被保持. 通过控制样品架的倾斜角度获得同样分子在不同已知投影角度下的图象. 又称”Random ConicalTilt”. Untilted Tilted如果能获得足够多的样品在不同角度的二维投影图象, 三维结构就可以通过在傅里叶空间重构以及实空间转换而得到. 对于不具规则排列的样品, 主要有两种方法取得这些图象.样品具规则排列时的三维重构方法 螺旋对称性大分子三维重构,如microtubule (8 ), Tobaccomasaic virus (10 ). 电子晶体学, 如Bacteriorhodopsin (3 ),Aquoporin (1.9 ).Aquaporin structure shows protein-lipid interaction电镜主要用于三个方向的研究 单晶粒三维重构(Single-particle reconstruction)适合于200KD及以上的蛋白或蛋白聚合体的结构研究. 所得结构的分辨率依赖于样品自身特性(如对称性)、样品的制备(如冰冻条件的选择)、电镜状态(如所加电压)和数据处理方法(如算法的选择). 可达到10 以上,在这个分辨率上可以分辨alpha螺旋结构. 达到更高的分辨率只是时间的问题. 电子晶体学(Electron crystallography)适合于膜蛋白的结构研究. 分辨率(最高的达1.9 )已经可与X射线晶体学相婢俾美. 分辨率依赖于二维晶体的质量, 与膜蛋白的提取方法、去污剂的选择、脂的种类、冰冻处理方法都有关. 电子断层重构(Electron tomography)适合个体差异性比较大的样品. 这些结构无法通过单晶粒三维重构中的平均化得到. 如流感病毒颗粒、疱疹病毒颗粒、亚细胞结构如高尔基体、线粒体等等. 这种手段的分辨率目前还较低, 30或更低.Symmetry An operation, such as a rotation, that brings an object into selfcoincidence. For proteins, only feasible operations are rotation, translationand combination of two (such as helical symmetry). Handedness Icosahedral symmetry Helical symmetry Cn symmetry Dn symmetrySingle Particle Data Processing Applicable to anyprotein or proteincomplex 200kD Most common sample A number of softwaresuites availablePick particles (manual or semi-auto)astigmatism, drift, charging etc.First model How to classify particles Reference free classification and alignment MSA (Multivariate Statistical Analysis
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