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大肠杆菌基因组 DNA 的提取一、传统法提取大肠杆菌基因组 DNA。1、实验原理提取 DNA 的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶 K 的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿 /异戊醇抽提分离蛋白质,得到的 DNA 溶液经乙醇沉淀使 DNA 从溶液中析出。SDS 的作用机理是由于其能结合蛋白,中和蛋白的电性,使蛋白质的非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 均为光谱蛋白酶,其重要特性是能在 SDS 和 EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中,SDS 可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白和 DNA 分离;而蛋白酶 K 可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使 DNA 分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀 DNA。为获得高纯度 DNA,操作过程中常加入RNaseA 除去 RNA。CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7 mol/L NaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定的程度(0.3 mol/L NaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将 CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀 DNA,而 CTAB 溶于乙醇或异丙醇而除去。2、实验试剂与仪器1)实验材料:大肠杆菌2)实验试剂:LB 液体培养基,TE 溶液,10%SDS,蛋白酶 K, 5mol/L NaCl, CTAB/NaCl 溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇3)实验仪器:恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1)LB 液体培养基:细菌培养用胶化蛋白胨 10 g/L,细菌培养用酵母提取物 5 g/L,NaCl 10g/L ,去离子水。(搅拌溶解后,用 5mol/LNaOH 调 pH 至 7.0.用去离子水定容 100ml,用 20/50ml摇瓶分装 5 瓶,包扎好,在 121,1.034105 pa 高压下蒸汽灭菌 20min.)2)TE 缓冲液:1M Tris 溶液(取 Tris242.2g,加 ddH2O 至 1600ml,加热溶解)1M tris-HCl pH8.0 溶液(取 1M Tris 溶液 160ml 用分析纯盐酸调至 Ph=8.0(需浓盐酸约 8.5ml),加 ddH2O 定容至 200ml,高压灭菌备用) TE 缓冲液(10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0 ,1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml 向烧杯中加入约 400mldd H2O 均匀混合;将溶液定容到 500ml 后,高温高压灭菌,室温保存)3)蛋白酶 K:(20mg 蛋白酶 K 溶于 1ml 无菌双蒸水, -20备用)4)CTAB/NaCl 溶液:(5% w/v,5gCTAB 溶于 100ml 0.5M NaCl 溶液中,需加热到 65使之溶解,然后室温保存) 4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的 LB 培养基中,一级培养过夜,以 10%的接种量进行二级培养,培养至对数期(4-6h)。2、取菌液 1.5ml 置于离心管中,以 5000rpm 冷冻离心 1min,弃上清液3、加 190 ul TE 悬浮沉淀,并加 10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入 1ul 蛋白酶 K(20mg/ml),混匀,37保温 1 小时。5、加 30ul 5 mol/L NaCl,混匀。6、加 30ul CTAB/NaCl 溶液,混匀,65保温 20min7、加入 300ul 酚/氯仿/异戊醇抽提(25:24:1),5000rmp 离心 10min8、取上清液,加入 300ul 氯仿/异戊醇(24:1)抽提,5000rmp 离心 10min9、取上清液,加入 300ul 的异丙醇,颠倒混匀,室温下静止 10min,沉淀DNA,5000rmp 离心 10min10、加 500ul 70%乙醇洗沉淀,5000rmp 离心 10min11、弃上清液,待酒精挥发尽后加 30ulTE 溶解12、溶解于 20ul TE 中,-20保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组 DNA。细菌基因组 DNA 提取试剂盒:1、TGuide 细菌基因组 DNA 提取试剂盒DP302-02 50 次 420 元2、TaKaRa 细菌基因组 DNA 小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650 元3、Biomiga 细菌基因组 DNA 提取试剂盒GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50 次 423 元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250 次 1798 元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50 次 400 元BSC12M1 100 次 750 元5、OMEGA 细菌基因组 DNA 提取试剂盒D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210 元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200 3350 元荧光定量 PCR 试验(标准曲线法)定量实验是一种实时实验,用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 (靶)数量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。【实验原理】在实时定量实验中,反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的,而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。在 PCR 的最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。该预定义的 PCR 循环范围称为基线。首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度 (与基线循环相对应的 Rn 值)的数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 ( delta Rn Rn 值)与阈值交叉的点。 Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT。一、试验设计使用 StepOne 软件中的 Design Wizard(设计导向)创建新实验1、定义实验属性在 Experiment Properties (实验属性)屏幕上,输入实验的标识信息,然后选择要设计的实验类型。1)Experiment Name (实验名称)。2)Barcode (条码),然后输入您的 PCR 反应板上的条码。(可不填)3)User Name (用户名)。4)Comments (注释)。(可不填)5)选择 Quantitation (定量)实验类型6)Next (下一步)2、定义方法和材料在 Methods & Materials (方法和材料)屏幕上,选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和 PCR 模板。1)将 Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。将 Standard Curve (标准曲线)选为定量方法。 标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。 从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。 当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品和样本。用于标准曲线实验的 PCR 反应包括以下组分: 样本 其中靶数量未知的样本。 标准品 数量已知的样本。 标准品稀释序列 一组用于构建标准曲线的标准品稀释液 (例如,1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32) 。 重复数 含有相同组分和量的相同反应数。 阴性对照 含有水或缓冲液的样本,不含模板;也称为 “ 无模板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2)为试剂选择 TaqMan Reagents ( TaqMan 试剂)(包括两个引物一个探针) 。如果使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量,则选择TaqMan Reagents ( TaqMan 试剂) 。 TaqMan 试剂包括两个引物和一个TaqMan 探针。 引物设计用于扩增靶。 TaqMan 探针设计用于杂交靶,并在扩增靶时产生荧光信号。切记! Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量,则选择 SYBR Green Reagents ( SYBR Green 试剂)。 SYBR Green 试剂包括两个引物和 SYBR Green 染料。 引物设计用于扩增靶。 SYBR Green 染料可在结合到双链 DNA 时产生荧光信号。 SYBR Green 染料通常是添加到反应的SYBR Green 母液的一部分。 如果使用 SYBR Green 染料:选择 Include Melt Curve (包括解链曲线)以执行扩增靶的解链曲线分析。将 Standard (标准)选为升降温速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 试剂的 Fast 母液。3)为升降温速度选择 Standard (2 hours to complete a run) (标准 (约两小时完成运行) 。 如果为 PCR 反应使用 Fast 试剂,则选择 Fast (40 Minutes toComplete a Run) (快速 (约 40 分钟完成运行) )。 如果为 PCR 反应使用标准试剂 (包括 SYBR Green 试剂和 TaqMan 试剂),则选择 Standard (2 Hours to Complete a Run) (标准 (约 2 小时完成运行) 。4)为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) ( gDNA (基因组 DNA) ) 。5)Next (下一步) 。3、设置靶在 Targets (靶)屏幕上,输入您想在 PCR 反应板中定量的靶数量,然后为每个靶设置检测。1)单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? (您想在反应板中定量多少靶?)字段,然后输入 1(根据需要填)。注意: 靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。2)选择 Set Up Standards (设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。注意: Set Up Standards (设置标准品)复选框默认情况下已选取。3)设置靶 1 检测:a. 单击 Enter Target Name (输入靶名称)单元格,然后输入 RNase P(示例) 。b. 从 Reporter (报告基团)下拉菜单中,选择 FAM (默认) 。 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端,则选择 FAM。 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端,则选择JOE。 如果要将 VIC 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端,则选择VIC。 如果您正使用 SYBR Green 染料以检测双链 DNA,则选择 SYBR 。c. 从 Quencher (淬火基团)下拉菜单中,选择 NFQ-MGB (默认) 。 如果要将非荧光淬火基团小沟结合物加在您正用于检测靶的 TaqMan 探针的 3 端,则选择 NFQ-MGB。 如果您正使用 SYBR Green 染料,则选择 None (无) 。4)Next (下一步)
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