安 徽 医 科 大 学硕 士 学 位 论 文短 期 高 浓 度 氟 对 小 鼠 磨 牙 胚 中 牙 本 质 涎 蛋 白 表 达 的 影 响姓 名 ： 张 菁申 请 学 位 级 别 ： 硕 士专 业 ： 口 腔 临 床 医 学指 导 教 师 ： 梅 陵 宣20100501安徽医科大学硕士学位论文短期高浓度氟对小鼠磨牙胚中牙本质涎蛋白表达的影响中文摘要背景 牙 齿 发 育 是 由 牙 源 性 上 皮 与 颅 神 经 嵴 来 源 的 外 胚 间 充 质 之 间 相 互 诱 导 、 相互 作 用 的 复 杂 过 程 ， 其 中 ， 牙 本 质 不 同 于釉质 ， 来 源 于 外 胚 间 充 质 ， 是 由 型胶原 和 牙 本 质 非 胶 原 蛋 白 先 形 成 支 架 ， 碳 磷灰石 晶 体 再 结 合 到 此 支 架 上 所 形 成 。 牙本 质 涎 蛋 白 （ dentin sialoprotein, DSP） 占 非 胶 原 有 机 成 分 中 的 多 数 ， 在 牙 本 质 生 长发 育 过 程 中 发 挥 了 重 要 作 用 。 氟 化 物 作 为一种 有 效 的 防 龋 药 物 ， 近 年 来 得 到 广 泛应 用 。 然 而 ， 在 牙 齿 发 育 阶 段 通 过 急 性 和慢性 的 方 式 摄 入 过 量 的 氟 均 会 抑 制 成 牙本 质 细 胞 的 增 殖 分 化 及 随 后 的 基 质 合 成 与分泌 ， 从 而 影 响 牙 本 质 的 发 育 。 其 特 异性 发 生 机 制 目 前 尚 无 定 论 。目的 通 过 研 究 短 期 高 浓 度 氟 对 新 生 小 鼠 下 颌 第 一 磨 牙 不 同 分 化 阶 段 的 成 牙 本 质细 胞 形 态 及 细 胞 内 DSP 表达的影响，探讨过量氟对牙本质发育的作用机制以及对DSP 生 物 活 性 的 影 响 。方 法 从 8 窝 4 日 龄 （ postnatal day 4, PND4） 小 鼠 里 随 机 抽 取 32 只 ， 雌 雄 各 半 ，根 据 单 次 腹 腔 注 射 药 物 剂 量 的 不 同 ， 按 照完全 随 机 分 配 的 原 则 先 分 成 两 组 ， 即 高剂 量 组 （ 20mg /kg b.w.） 和 低 剂 量 组 （ 10mg /kg b.w.） ，每组 16 只 ， 然 后 于 各 组 中随 机 分 为 NaF 实 验 小 组 和 NaCl 对 照 小 组 ， 每 小 组 内 动 物 数 量 均 为 8 只 。 注 射 药 物前 称 体 重 ， 注 射 时 统 一 按 10l /g b.w (body weight, 体 重 )进 行 ， 即 药 物 高 、 低 浓 度分 别 为 2mg /ml 和 1mg /ml，完成后所有小鼠返回各自母鼠。2 4 小 时 后 处 死 动 物 。实 验 前 后 对 所 有 动 物 称 重 ， 分 析 单 次 腹 腔 注 射 NaF 和 NaCl 一 日 后 的 小 鼠 体 重 参 数有 无 统 计 学 差 异 。 采 用 HE 染 色 ， 光 镜 下 观 察 不 同 浓 度 氟 对 小 鼠 下 颌 第 一 磨 牙 成 牙本 质 细 胞 不 同 分 化 时 期 的 细 胞 组 织 形 态 学 变 化 , 探 讨 不 同 时 期 成 牙 本 质 细 胞 对 氟敏 感 性 的 差 异 。 SP 免疫组化技术检测 DSP 在对照组与实验组小鼠下颌第一磨牙成3安徽医科大学硕士学位论文牙 本 质 细 胞 中 的 表 达 定 位 ， 运 用 生 物 图 像分析 系 统 软 件 测 得 相 应 结 果 的 平 均 光 密度 值 。 统 计 学 处 理 ： SPSS13.0(Statistical package for the social science, 社 会 科 学 统计 软 件 包 ) 建 立 数 据 库 并 进 行 统 计 学 分 析 。结 果 实 验 过 程 中 未 见 动 物 死 亡 ， 经 统 计 学 分 析 ， 药 物 注 射 24 小 时 后 ， 小 鼠 体 重增 长 在 组 间 差 异 无 显 著 性 。 HE 染 色 结 果 显 示 ： 对 照 组 （ 分 别 注 射 10mg /kg b.w.和20mg /kg b.w.的 NaCl） ， 分 泌 期 成 牙 本 质 细 胞 呈 高 柱 状 整 齐 排 列 ， 细 胞 核 远 离 基 底膜 ， 牙 本 质 基 质 均 匀 红 染 ， 其 间 可 见 牙 本质小 管 ， 成 熟 期 成 牙 本 质 细 胞 由 高 柱 状逐 渐 向 矮 立 方 状 转 化 。 实 验 组 （ 分 别 注 射 10mg /kg b.w.和 20mg /kg b.w.的 NaF） ，细 胞 的 形 态 学 改 变 大 体 相 同 ， 但 存 在 细 微差异 ： 部 分 分 泌 晚 期 的 成 牙 本 质 细 胞 有时 可 见 空 泡 性 变 ， 高 度 变 矮 ， 正 常 的 柱 状结构 丧 失 ， 极 性 消 失 ， 排 列 紊 乱 ， 但 这些 损 害 被 限 制 在 相 对 孤 立 的 区 域 ， 成 牙 本质细 胞 上 方 的 牙 本 质 表 面 可 见 不 规 则 的改 变 。 两 组 中 成 熟 期 成 牙 本 质 细 胞 及 对 应的牙 本 质 均 未 见 明 显 异 常 。 免 疫 组 化 染色结果显示：D SP 在成釉细胞、成牙本质细胞、牙髓组织中均有表达。实验组与对 照 组 相 比 ， 在 前 期 牙 本 质 和 牙 本 质 中 也有阳 性 表 达 ， 其 表 达 在 分 泌 期 的 成 牙 本质 细 胞 中 明 显 增 强 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （ P0.05） 。结 论 短 期 高 浓 度 氟 改 变 分 泌 期 成 牙 本 质 细 胞 的 细 胞 形 态 ， 增 强 了 DSP 在分泌期成 牙 本 质 细 胞 中 的 表 达 ， 干 扰 了 上 皮 -间 充 质 之 间 正 常 的 信 号 传 导 ， 从 而 影 响 牙 本质 的 发 育 ， 成 熟 期 成 牙 本 质 细 胞 未 见 明 显 变 化 。关键词 氟 化 物 成 牙 本 质 细 胞 牙 本 质 涎 蛋 白4安徽医科大学硕士学位论文Effect of Short Exposure to High Levels of Fluoride on theExpression of DSP in Odontoblasts of Mouse MolarAbstractBackground The development of tooth germ is a multi-step and complex process ofinteraction between epithelial and mesenchymal tissues. Although dentin, unlike enamel,is derived from mesenchyme, which involves secretion of mainly type I collagen andseveral noncollagenous proteins to form a collagenous scaffold.Next, carbonate apatitecrystals are deposited on the existing scaffold. Dentin sialoprotein(DSP) is in majorityof the noncollageous proteins(NCPs) ,which play essential roles in the growth anddevelopment of dentinogenesis. During the tooth development, however, intakingexcessive amounts of fluoride through acute and chronic ways can induce dentindifferentiatiation of the odontoblasts and secretion of matrix.This lead to the abnormaldevelopment of dentinogenesis,but the specific mechanisms could not be determined.Objective To study the effect of short exposure to high levels of fluoride inducesstructural changes and the expression of DSP in odontoblasts of mouse molar, furthermore,explore the mechanism for action of overdose fluoride on odontoblasts, thechanges of the biological activities of DSP.Methods Thirty-two ICR mice ( postnatal day four, PND4 ) from eight differentlitters were used. The mice from each litter were divided randomly into two groups. Theexperimental animals and the control animals shared equal numbers in each group. Theexperimental animals were received a single intraperitoneal dose of 20 (n=8) and 10 mg(n=8) NaF/kg b.w. respectively, equal doses of NaCl were given to the controls. Theinjected volume was kept constant (10l/g b.w.). After the injections, the mice were5安徽医科大学硕士学位论文returned to their respective mothers. Both the experimental and control animals wereweighed before and after the experiment to check the effect of fluodide on body weight.After twenty-four hours all mice were sacrificed. Hematoxylin-eosin stain was used toobserve the structural changes and to explore the differences of sensitivity to fluodide inodontoblasts of mandibular first molars of mice at different stages. Immunohistochemi-cal stain was used to detect theexpression of DSP in the odontoblasts of control andexperimental groups. Bio-image analysi