嗜冷菌对牛乳的危害及检测控制 韩中惠 1，黄艾祥 1，毛华明 2，范江平 1，* 1云南农业大学食品科技学院 云南昆明 650201， 2.云南农业大学动物科学技术学院 云南昆明 650201摘要：嗜冷菌及其代谢产生的酶是引起原料乳及乳产品发生酸 包、乳清分离等腐败变质的主要原因之一。本文综述了嗜冷菌的分 类，分析了牛乳中嗜冷菌的来源与危害，并介绍了嗜冷菌的检测方 法及对嗜冷菌的控制措施。关键词：嗜冷菌；来源；危害；检测方法；控制措施近几年来，我国的奶类总产量增长迅速，2011 年奶类总产量 达 3825 万吨。据预计，未来 5 年原料奶产量仍将以高速稳步增长。 原料奶营养丰富，是微生物的良好培养基，属高危险性食品原料。 严重污染的原料奶，蛋白质和脂肪会被微生物产生的酶所氧化或水 解，奶胶体系统丧失原有的稳定性，并产生风味缺陷。这样的奶已 无法经受某些加工处理，生产的产品也不再具有乳香味，整体质量 受到破坏。如果奶中微生物种类多、数量高，直接影响杀菌效果， 使奶制品的保质期缩短，易引起其腐败变质，传播疾病，危害人体 健康。 原料奶中嗜冷菌对不同的乳制品都会造成不利的影响，国外早在 20 世纪 80 年代，在乳品生产过程中已经建立了完善的嗜冷菌检测体系。 我国在乳品生产过程中，对嗜冷菌的控制还没有引起足够的重视，国家检测标准中也尚未有明确的规定。近年来由食品卫生问题而导 致的多起消费事故，导致人们对食品的安全性提出了更高的要求。 因此，加强对嗜冷菌的检测和控制，有助于提高乳及乳制品的质量， 保证消费者的食用安全性。 1.嗜冷菌的定义和分类 1.1 嗜冷菌的定义1887 年 Forster 首次发现在 0时，鱼中仍具有在生长能力的 微生物1。1902 年 Schmidt-Nielsen 首次对该类微生物做了定义： 能 够在 0生长繁殖的微生物称之为嗜冷菌2。在微生物学术界对嗜 冷菌的定义有很多种。目前在乳制品行业中，国际乳品联合会 （IDF）对嗜冷菌的定义是公认的。 国际乳品联合会（IDF）定义嗜 冷菌为：能够在 7及以下能生长繁殖的微生物为低温菌；在 20 及以下能生长繁殖，在 10-15 为最适生长温度的微生物称为嗜冷 菌。由于嗜冷菌长期生活在低温条件下，自身形成了一系列适应低 温机制，这一机制主要表现在细胞生物膜、细胞内的酶、冷休克蛋 白、基因调控等3。 1.2 嗜冷菌的分类嗜冷菌在自然界的分布范围极其广泛。在高山上、极地地区， 以及大洋深处嗜冷菌都可以存在；与此同时，人工制冷设备冰箱、 冷库中也大量存在嗜冷菌。很多人将嗜冷菌分为 2 类，1986 年 Hucker 将嗜冷菌进行细分，定义那些只能生活在低温下且最高生长 温度不超过 20，最适生长温度等于或小于 15，在 0及以下都可以繁殖生长的嗜冷菌为专性嗜冷菌(Psychrophile); 将最高生长温度 可以超过 20，在 0-5 的环境中可以生长，一般生长温度范围在 0-35 的嗜冷菌定义为兼性嗜冷菌(Psychrotroph)4 。 经过研究人员的分离鉴定，目前乳中嗜冷菌的主要种属有：假单胞 杆菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes) 、黄杆菌属 (Flarobacterium)、色杆菌属(Hromobacterium) 肠道杆菌属 (Enterbacteriaceae)、微球菌属(Micricoccus)、链球菌属(Streptococus)、 乳杆菌属(Lactobacillus)等，其中假单胞杆菌属(Pseudomonas)中的荧 光假单胞菌(P. fluorescens)最为常见5 。 2.牛乳中嗜冷菌的来源与危害 2.1 牛乳中嗜冷菌的来源嗜冷菌最主要来源于原料乳中。经过巴氏杀菌或者超高温杀菌 等杀菌方式后，牛乳中的嗜冷菌含量极少，无菌包装后的牛乳很难 再受到外界环境的污染。因此嗜冷菌最主要存在于原料乳中，也就 是说牛乳受到嗜冷菌污染的阶段在加工前。加工前的牛乳受到嗜冷 菌污染来源主要有以下几个方面。 2.1.1 自然环境嗜冷菌在自然界中广泛存在，在采集牛乳时易受到空气和水中 的嗜冷菌污染。如果是手工挤奶，在挤奶的过程中牛乳与空气接触 的机会很大，空气中的嗜冷菌很有可能落入牛乳中；牧区的条件有 限，使用的水多是井水，井水中的嗜冷菌比自来水的多，牛乳受到 井水污染的程度加大。2.1.2 挤奶及储运设备在挤奶器衬内表面和冷却罐中含有嗜冷菌的数量较多6，特 别是设备停车期间，如果设备清洗不彻底，嗜冷菌会大量的繁殖， 而造成对原料奶二次污染。 2.1.3 奶牛的乳房和乳头表面苏景辉等人对管理一般和管理较好的牧场中的奶牛乳房和乳头 表面进行检测都发现有嗜冷菌的存在6。 2.2 嗜冷菌对牛乳的危害嗜冷菌本身对牛乳的危害不是很大，因为经过杀菌后，牛乳中 的嗜冷菌几乎完全杀灭。这类细菌的大多数可被巴氏杀菌杀死，但 菌体生长过程中产生的胞外酶（蛋白酶、脂酶）却具有抗热性，可 以在巴氏消毒乳中保留其酶活性，进而因酶的作用影响原料乳和终 产品的风味和质量7。对牛乳造成巨大危害的热稳定性酶类物质一 般分为两大类：一类是热稳定性蛋白酶，另一类是热稳定性脂肪酶。 2.2.1 热稳定性蛋白酶对牛乳的危害原料乳中的对热稳定性蛋白酶有两类：牛乳自身的纤维蛋白溶 酶(胞浆素)和由嗜冷菌产生的耐热蛋白酶8。嗜冷菌产生的蛋白酶 为影响乳及乳制品质量的主要因素9。 嗜冷菌产生的耐热性蛋白酶具有耐高温性，在杀菌中并不能完全失 活，此类酶可以水解牛乳中蛋白质。方海红等人将嗜冷菌产生的耐 高温蛋白酶分为三种形式：胞内酶、胞壁蛋白酶和胞外蛋白酶10。这三种酶经高温处理后仍有较强的复性能力，没有失活的部分蛋白 酶，能够重新恢复原来的活性。该残留的蛋白酶可以分解 -酪蛋白 和 -酪蛋白，造成蛋白质失去稳定性，蛋白发生聚集并随自身重力 作用沉于底部，使乳清逐渐析出11。同时该类蛋白酶在分解乳中 蛋白时，还会使牛乳释放出带苦味的氨基酸和短肽，并且颜色褐变。 此外，在加工过程中，这些耐热性蛋白酶还会造成片式热交换器的 淤塞，对设备清理难度加大；嗜冷菌还会在设备的表面和胶垫上形 成生物膜。 2.2.2 热稳定性脂肪酶对牛乳的危害乳中的脂肪酶主要由原料乳的天然脂肪酶和嗜冷菌所产生的脂 肪酶两部分组成12。 嗜冷菌所产生的脂肪酶具有良好的耐热性。在经 138处理后，该脂 肪酶活力仍能维持原先的一半；1981 年 Adams 发现假单胞杆菌 MC50 产生的脂肪酶在 100 时 D 值达到 63s13；还有其它的研究 者发现荧光假单胞菌产生的热稳定性脂肪酶 150时的 D 值可达到 了 290s14，可见该酶的耐热性很强。这些耐热的脂肪酶可以分解 脂肪释放出游离脂肪，游离出的脂肪能将脂肪球粘合在一起产生脂 肪球簇，使牛乳的脂肪上浮；脂肪酶还可以对脂肪球膜进行分解， 使脂肪球出现聚集发生脂肪上浮15。当原料奶中嗜冷菌数量超过 106 cfu/ml，过多的蛋白酶和脂肪酶将导致 UHT 奶制品产生凝块、 发芽，并产生脂肪氧化味。 3.嗜冷菌的检测与控制方法3.1 嗜冷菌的检测方法对于嗜冷菌的检测方法可以大体的分为 2 大类：传统平板计数 法和与现代技术结合法。这些方法仍具有一些局限性，目前尚需研 究出省时、经济、高效的检测方法。 3.1.1 传统平板计数法传统平板计数法主要是：IDF Standard 101A 对嗜冷菌培养温度 为 4-6，培养时间为 10d16；IDF Standard 132A 对嗜冷菌的培 养温度为 21，培养时间为 24h17。前者的结果不如后者的准确， 后者比前者检测速度快。纪振杰等通过使用标准平板计数法与 3M 细菌总数测试纸片法检测原料乳中嗜冷菌数的比较实验，确定 3M 细菌总数测试纸片法为快速、精确的检测嗜冷菌数的方法18。 3.1.2 现代检测技术由于中国乳品产业起步晚，所以国内现代检测技术应用没有 国外那么普遍。与现代技术结合的检测方法主要有 rDNA 核酸序列、 荧光标记物29、ELISA 法20、肽核酸探针等。任静等人通过对酶 活性的检测来建立嗜冷菌与产物耐热性脂肪酶的关系，进而得到嗜 冷菌数21。由于现代检测技术需要昂贵的仪器设备和实验药品， 在乳制品工业中尚不能普遍使用。 3.2 嗜冷菌的控制方法嗜冷菌的动态增加与耐热蛋白酶和耐热脂肪酶活力变化趋势大 致相同，对牛乳的货架期产生影响22。由此可见控制嗜冷菌的数 量和耐热酶是非常有必要的。目前，国内外对嗜冷菌的有效抑制方法还报道的不多，有利用 CO2 来进行减少嗜冷菌数量的，有利用化 学杀菌剂的，还有添加金属离子的。牛乳中嗜冷菌的数量可以从牛 乳加工前和加工过程两个阶段采取控制措施。 3.2.1 牛乳加工前。原料乳中本身含有的嗜冷菌极少，主要是外源嗜 冷菌的侵染。3.2.1.1 注意消毒。在原料乳采集时一定要注意对周围 的环境、牛的乳房和乳头、挤奶器具、储运工具等彻底消毒。 3.2.1.2 缩短加工前牛乳的储藏时间。 3.2.1.3 深度冷藏。温度较低时，嗜冷菌的生长表现较长的延滞期和 世代间隔，原料奶中常见嗜冷菌在 4时平均代时为 89 h23。 3.2.1.4 添加安全防腐剂。如添加聚磷酸盐、乳酸链球菌素（Nisin） 、 0.5%的壳寡糖等8。 3.2.1.5 利用无害技术。如超声波、电离辐照保鲜、脉冲电场杀菌、 添加乳过氧化氢酶体系等。 3.2.2 牛乳加工过程。 3.2.2.1 建立健全 HACCP 和 GMP。在生产的过程中要严格按照 HACCP 和 GMP 的要求，严格清洗管道。 3.2.2.2 灭菌时调控时间和温度。如巴氏预处理，嗜冷菌的胞外蛋白 酶和脂肪酶具有不能耐受中温性，在 55下 5-6 min 这些酶很容易 破坏；还有人利用低温钝化方法(LTI)来提高 UHT 乳的货架期，将 超高温灭菌（140、5 s）处理后的牛奶冷却至 60，保持 5 min ， 可有效地钝化嗜冷菌产生的蛋白酶和脂肪酶24。 4.小结 原料乳生产中嗜冷菌污染是常见的问题之一，嗜冷菌还影响牛 乳的品质，使牛乳的发生腐败变质现象。这一原因的主要是嗜冷菌 的耐热酶导致的。在实际的生产过程中一定要树立防止细菌污染的 意识，在生产加工的各个环节注意良好的操作规范和加强监管。要 最终解决这个问题，还需要进一步研究清楚嗜冷菌及其耐热酶在牛 乳中的作用机制。