学校代码： 1 0 2 6 4研究生学号： M100105249上 海 海 洋 大 学硕 士学位 论 文稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因克隆、序列分析及题 目：mRNA 定量检测Cloning, sequence and mRNA quantitative英文题目： analysis of vitellogenin gene of fishGobiocypris rarus专 业： 海洋生物学研究方向： 水产动物养殖与繁殖生物学姓 名： 黄婷妹指导教师： 蔡生力、刘红二 O 一三年三月二十八日1上 海 海 洋 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明本 人 郑 重 声 明 ： 我 恪 守 学 术 道 德 ， 崇 尚 严 谨 学 风 。 所 呈 交 的 学 位论 文 ， 是 本 人 在 导 师 的 指 导 下 ， 独 立 进 行 研 究 工 作 所 取 得 的 成 果 。 除文 中 已 经 明 确 注 明 和 引 用 的 内 容 外 ， 本 论 文 不 包 含 任 何 其 他 个 人 或 集体 已 经 发 表 或 撰 写 过 的 作 品 及 成 果 的 内 容 。 论 文 为 本 人 亲 自 撰 写 ， 我对 所 写 的 内 容 负 责 ， 并 完 全 意 识 到 本 声 明 的 法 律 结 果 由 本 人 承 担 。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ： 年 月 日上 海 海 洋 大 学 学 位 论 文 版 权 使 用 授 权 书学位论文作者完全了解学校有关保留、 使 用学位论文的规定，同 意 学 校 保 留 并 向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 电 子版 ， 允 许 论 文 被 查 阅 或 借 阅 。 本 人 授 权 上 海 海 洋 大 学 可 以 将 本 学位 论 文 的 全 部 或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检 索 ， 可 以 采 用 影印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 和 汇 编 本 学 位 论 文 。保 密 ， 在 年 解 密 后 适 用 本 版 权 书 。本 学 位 论 文 属 于不 保 密学 位 论 文 作 者 签 名 ： 指 导 教 师 签 名 ：日 期 ： 年 月 日 日 期 ： 年 月 日2上海海洋大学 硕士学位论文答辩委员会成员名单3姓 名 工 作 单 位 职 称 备 注主 席委 员委 员委 员委 员委 员委 员秘 书答 辩 地 点 答 辩 日 期稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因克隆、序列分析及mRNA 定 量 检 测摘 要稀 有 鮈 鲫 （ Gobiocypris rarus）是我国特有的一种小型鲤科鱼类，并已作为 一 种 新 型 的 模 式 实 验 鱼 应 用 于 鱼 类 遗 传 学 、 鱼 病 学 、 环 境 科 学 以 及 转 基 因 观 赏鱼 等 研 究 领 域 。 卵 黄 蛋 白 原 (vitellogenin， Vg)是 卵 生 动 物 卵 黄 形 成 过 程 中 大 量存 在 于 雌 性 动 物 血 液 中 的 富 含 糖 、 脂 、 磷 的 高 分 子 量 蛋 白 ， 是 几 乎 所 有 卵 生 动 物卵 黄 蛋 白 的 前 体 。 本 实 验 根 据 NCBI 网站上公布的稀有鮈鲫卵黄蛋白原 cDNA 序 列设 计 引 物 ， 通 过 普 通 PCR 技 术 获 得 6299 bp 序 列 ； 然 后 以 获 得 的 6299 bp 序 列的 5端为模板，设计两对引物，通过基因组步移技术克隆得到 1285 bp 的 序 列 。经 过 Seqman 拼 接 软 件 后 得 到 7573 bp 序 列 ， 其 中 卵 黄 蛋 白 原 基 因 全 序 列 长 6595bp， 上 游 调 控 序 列 978 bp。经开放性阅读框分析得到：稀有鮈鲫卵黄蛋白原基因 含 有 26 个 外 显 子 和 25 个 内 含 子 ， 编 码 1299 个 氨 基 酸 序 列 ， CDS 长 3900 bp。将 稀 有 鮈 鲫 卵 黄 蛋 白 原 cDNA 基 因 序 列 进 BLAST( http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )同 源 性 分 析 ， 结 果 发 现 ： 所 得 的 序 列 与 斑 马 鱼 、 鲮 、 喀 拉 鲃 、 唐鱼 、 锦 鲤 卵 黄 蛋 白 原 基 因 cDNA 序 列 的 相 似 性 分 别 为 69 %、 88 %、 87 %、 63%、70%；经预测得到的稀有鮈鲫卵黄蛋白原氨基酸序列，与斑马鱼、鲮、喀拉鲃、唐 鱼 、 锦 鲤 卵 黄 蛋 白 原 氨 基 酸 序 列 进 行 比 对 ， 相 似 性 分 别 为 76%、 85%、 91%、 82%、88%。 通 过 开 放 性 阅 读 框 分 析 ， 还 发 现 ， 与 斑 马 鱼 相 比 ， 稀 有 鮈 鲫 卵 黄 蛋 白 原 中插 入 了 一 段 序 列 ， 长 度 为 21 bp， 位 于 第 1 外 显 子 和 第 3 外 显 子 之 间 ， 可 能 导 致7 个 氨 基 酸 序 列 的 插 入 ； 另 外 ， 稀 有 鮈 鲫 卵 黄 蛋 白 原 第 22 个 外 显 子 （ 252 bp）比 斑 马 鱼 卵 黄 蛋 白 原 第 21 个 外 显 子 （ 312 bp） 少 了 一 段 60 bp 的 序 列 。 将 稀 有鮈 鲫 和 斑 马 鱼 卵 黄 蛋 白 原 基 因 序 列 均 去 除 内 含 子 ， 分 别 得 到 4212bp（稀有鮈鲫）和 4256 bp（ 斑 马 鱼 ） 的 卵 黄 蛋 白 原 基 因 编 码 区 ， 两 者 比 较 后 发 现 相 似 性 为 69%。经 BLAST 比 对 发 现 ， 稀 有 鮈 鲫 卵 黄 蛋 白 原 上 游 调 控 序 列 中 220 bp-838 bp 区 间 与朝 鲜 鱊 （ Acheilognathus yamatsutae）卵 黄 蛋 白 原 基 因 启 动 子 序 列 2857 bp-3144bp 区 间 有 80 %相 似 性 。根 据 稀 有 鮈 鲫 卵 巢 的 发 育 情 况 ， 可 以 将 稀 有 鮈 鲫 的 卵 巢 分 为 六 期 。 本 实 验 以稀 有 鮈 鲫 卵 巢 发 育 三 个 不 同 时 期 ,卵黄发生前期（第 I 期 ） 、 卵 黄 发 生 期 （ 第 II4期 ） 、 卵 巢 成 熟 后 期 （ 第 III 期）为研究对象，取肝脏组织提取 RNA， 通 过 荧 光定 量 PCR 技 术 检 测 稀 有 鮈 鲫 卵 黄 蛋 白 原 的 mRNA 在 三 个 时 期 内 的 定 量 表 达 。 结 果发现，在肝脏中，随着卵巢的发育，在第 II 期 中 卵 黄 蛋 白 原 m RNA 的 表 达 量 最高 ， 相 对 表 达 量 达 到 25.202， 而 第 I 期 和 第 III 期 较 低 ， 仅 2.4 和 1.0。 本 研 究结 果 为 丰 富 鱼 类 繁 殖 发 育 生 物 学 ， 进 一 步 探 索 稀 有 鮈 鲫 这 一 具 有 重 要 研 究 价 值 的鱼 类 提 供 科 学 依 据 。关 键 字 ：稀有鮈鲫，卵黄蛋白原，基因组步移，序列分析，荧光定量5Cloning, sequence and mRNA quantitative analysis ofvitellogenin gene of fish Gobiocypris rarusABSTRACTAs a new mode of experimental fish,Gobiocypris rarus,a small cyprinids,hasbeen used in genetics, diseases, environmental science, as well as transgenicornamental fish and other research areas. Vitellogenin (VG) is a high molecularprotein with polysaccharide、 adipose and phosphorus,exist in the female animal bloodduring the oviparous animals yolk formation process.In this study, according topublished in the NCBI website Gobiocypris rarus yolk protein cDNA sequence,design primers by ordinary PCR technology 6299 bp sequence; using 6299 bp in thesequence of the 5 end as a template, design two primer for genome walking to clone1285 bp sequence. 7573 bp sequence after Seqman software, which vitellogenin genesequences of 6595 bp, upstream regulatory sequences of 978 bp. Gobiocypris rarusvitellogenin gene contains 25 exons and 25 introns, encoding 1299 amino acidsequence, CDS length 3900 bp after open reading frame analysis. After BLAST(http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) homology analysis, Gobiocypris rarusvitellogenin cDNA gene sequence was found that: from the sequence of Daniorerio ,Cirrhinus molitorella, Catla catla, Tanichthys albonubes, Cryprinus carpiodvitellogenin gene cDNA sequence similarity, respectively 69%, 88%, 87%, 63%, 70%;Gobiocypris rarus vitellogenin predicted amino acid sequence, and Daniorerio ,Cirrhinus molitorella, Catla catla, Tanichthys albonubes, Cryprinus carpiodvitellogenin amino acid sequence comparison, the similarity of 76%, 85%, 91%, 82%,88%, respectively. Open reading frame analysis also found that, compared to Daniorerio and Gobiocypris rarus vitellogenin inserted a sequence length of 21 bp, locatedbetween exon 1 and exon 3, could lead to seven amino acid sequence of the insert; 22outside of Gobiocypris rarus