1 细胞周期的流式检测方法 细胞周期（cell cycle ）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过 程，分为 G0/G1 期、S 期、G2/M 期。在科研实践中，很多实验具有对细胞群体的周期分 布进行检测的需求。细胞群体周期测定的方法有很多种，最常用的是 PI（碘化丙啶）渗入 DNA 进行染色，然后通过流式细胞仪检测 PI 从而测定细胞群体的周期分布。 因此，下面笔者主要通过 BD（BectonDickinson）公司生产的 BD FACSCalibur 流式 细胞仪测定 PI 标记的细胞群体为例，对细胞周期的流式检测方法进行阐述。 1、PI 染色步骤概略 1、单细胞悬液离心，1500rpm , 5min，弃上清。 2、PBS 1ml 离心，弃上清。 3、70%酒精 2ml ，4，30min ，离心，弃上清液。 4、PBS 1ml 离心，弃上清。 5、RNase A 的 PBS 溶液 (20ug/ml)，500ul ，37，30min ，离心弃上清。 6、PBS 1ml 离心，弃上清。 7、PI 的 PBS 溶液(50ug/ml) ，500ul，室温避光孵育 30min。 8、吹打混匀，300 目筛网过滤至流式管中，4保存，待测。 2、Calibur 仪器设置及数据收集 1、依次打开 Calibur 机器电源、电脑开关和 CellQuest Pro 软件，按快捷键 Command+B 连 机，按快捷键 Command+1、2、3、4 调出 Detectors/Amps 面板、Threshold 面板、 Compensation 面板和 Status 面板，软件的操作界面如图 1 所示。 图 1. Cell Quest Pro 软件操作界面 2、建立实验模板，包括 FSC/SSC 散点图、FL2-W/FL2-A 散点图和 FL2-A 直方图。因为 PI 在 Calibur 上是由 488nm 的激光器激发，530/30 滤光片收集信号，所以选择 FL2 通道进行 检测。细胞周期是 2N 和 4N 的循环，所以 FL2 通道的 Mode 参数应设置为 Lin 模式，同时 阈值（Threshold ）的 Primary Param 参数设置为 FL2-H ，Four Color DDM Param 参数设置2 为 FL2，如图 2、图 3 所示。 图 2. Detectors/Amps 面板 图 3. Threshold 面板 3、设置细胞的收集数目，数据保存的路径和名称，如图 4、图 5 所示。 图 4. AcquisitionStorage 面板3 图 5. Acquisition 面板 4、在图 6 所示的操作面板中，勾选 Setup 选项，点击 Acquire 按钮进行数据收集并调节 FL2 通道的电压值使得周期图位于 FL2 直方图中合适的位置。调好电压后，将 Setup 选项 勾掉，点击 Acquire 按钮收集数据。数据以.FCS 格式保存在之前预设好的文件夹中。 图 6. Acquisition Control 面板 3、细胞周期数据的分析 流式数据分析软件有很多种，比如 Cell Quest 、BD FCAS Diva、FlowJo 等等。但对于细胞 周期数据的分析，统一的分析步骤如下： 1、建立 FSC/SSC 散点图，圈定细胞群，如图 7 所示。4 图 7. FSC/SSC 散点图 2、建立 FL2-W/FL2-A 散点图，去除粘连细胞，如图 8 所示。 图 8. FL2-W/FL2-A 散点图 3、建立 FL2-A 直方图分析细胞周期，如图 9 所示。 图 9. FL2-A 直方图