河北大学2007届学年论文 1 细胞周期调控的分子机制 摘 要 细胞周期是生命活动中的一个最重要的过程，对它的研究是现代生命科学 研究的一个重要内容。细胞周期的动力主要来自于细胞周期蛋白依赖性激酶 (CDK)，它的活性则是通过细胞周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性激酶抑制剂 (CKI)进行调节。 关键词：细胞周期 分子调控 细胞周期蛋白 周期蛋白依赖性蛋白激酶河北大学2007届学年论文 2 ABSTRACT Cell cycle is one of the most important processes of the life. It is an important content of the study of modern life science research. The main driving force of the cell cycle comes from the cyclin-dependent kinase (CDK) and its activity is through the cyclin and cyclin-dependent kinase inhibitor (CKI) to regulate. Key words: Cell cycle Molecular Regulation Cyclin Cyclin-dependent protein kinase河北大学2007届学年论文 3 一 前言 近年来,以 Cyclin-CDK 为中心的细胞周期分子调控机制已经确立并取得了 很大的进展,即细胞周期蛋白(Cyclin)与细胞周期蛋白依赖性激酶(Cyclin- dependent kinase,CDK)结合后通过磷酸化调节一系列靶分子,这些下游分子激发 一系列下游事件的贯序发生,最终导致 DNA 的复制和有丝分裂,使细胞周期严格 按照 G1-S-G2-M 循环运转。另一方面在细胞周期正常事件受到干扰时,细胞会 采取补救措施进行调控,杜绝差错的发生。例如,在哺乳类细胞中,中等剂量 X 辐射导致的 DNA 损伤,可以通过 G1/S 期关卡点或 G2/M 期关卡点来阻断细胞周 期的异常运行,以赢得充分的时间来修复损伤的 DNA。这就是细胞周期关卡调 控(checkpoint control) 1 。关卡调控通过监测细胞分子事件的程序,也即保证细胞 周期在上游事件正确完成的前提下,才启动下游事件,确保细胞周期期相转换的正 确性,与 Cyclin/CDK 中心控制体系比较,它具有更为特殊的生物学意义 2 。由于 细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKI)通 过控制 Cyclin/ CDK 激酶复合物的有序激活和失活从而抑制细胞分裂并阻滞细 胞周期期相的转变,CKI 又被视为细胞周期关卡调控元件,对细胞周期进行负调控,特 别是在 G1/S 期、G2/M 期、中期/后期转换点起重要作用。 对于多细胞真核生物而言,细胞增殖还受机体的整体调控,所以各个细胞增殖 的调控除了上述细胞内源性因子的调控以外,还有细胞外源性因子的调控。河北大学2007届学年论文 4 二 本论 2.1细胞周期及其中心控制体系 2.1.1细胞周期 细胞周期(cell cycle)是保证细胞正确增殖的过程,对一个细胞而言,在分裂过 程中获得生存所必需的物质是最关键的环节,尤其是合成遗传所需物质。细胞周 期可划分为 4个时相,即 G1、S、G2 和 M 期。在 G1 期中,细胞不断生长发育。 当达到一定体积时,细胞就会进入 DNA 合成(S)期,细胞内遗传物质开始复制,最 终形成两套完整的染色体组,细胞便进入有丝分裂前的准备(G2)期。在有丝分裂 (M)期,染色体组分离、细胞质分裂,两套染色体平均分配给两个子细胞,从而完成 一个细胞周期。 2.1.2细胞周期调控理论的提出 生理学家和胚胎学家根据对海底无脊椎动物及两栖类卵细胞的研究结果， 认为细胞周期受一种不断在有丝分裂和间期(包括 Gl 期、S 期和 G2 期)之间来 回摆动的生化反应机制的控制，称之为时钟。理论家通过对停止在细胞周期特 定阶段的酵母突变体的分析，认为细胞周期是一系列依赖性事件准确而有序地 进行的过程，即后一事件的起始依赖于前一事件的完成，如有丝分裂的起始必 须依赖于 DNA 复制的完成，称为骨牌(domino)理论 3 。两种理论似乎很不一致， 但细胞融合实验研究结果发现，将 M 期的细胞与处于间期的任何阶段的细胞融 合后，可使处于间期的细胞出现有丝分裂现象，表明有丝分裂和间期的细胞质 是不同的，而有丝分裂的细胞质控制所有间期的细胞质的活动，此现象支持时 钟理论;另一方面，将处于两个不同间期(如 Gl 和 G2)细胞进行融合，则处于 G2 期的细胞必须等 Gl 期细胞进人 G2 期后才能使细胞周期继续进行，此现象 支持骨牌理论。后来就将这两种理论综合起来，认为所有细胞的细胞周期都是 受一种以磷酸化一去磷酸化为基础的中心控制体系的调控 4 。 2.1.3中心控制体系的分子基础 中心控制体系是由专门调控细胞周期的一系列基因表达产物所组成，其中 以周期素(Cyclin)基因和周期素依赖性蛋白激酶(CDK)基因这两大基因家族最为 关键。河北大学2007届学年论文 5 2.1.3.1周期素(Cyclin) Timothy Hunt(1983)首次发现海胆卵受精后，其卵裂过程中两种蛋白质的含 量随细胞周期剧烈振荡:在每一轮间期开始合成，G2/M 时达到高峰，M 结束后 突然消失，下轮间期时又重新合成，故命名为周期蛋白(Cyclin) 5 。后来在青蛙、 爪蟾、海胆、果蝇和酵母中均发现类似的情况，各类动物来源的细胞周期蛋白 mRNA 均能诱导蛙卵的成熟。在高等真核细胞中，Cyclin 分为 A、B、C、D 和 E 五类，它们分别在细胞周期的不同时期中合成、积累。 CyclinA 由 432个氨基酸组成，其中 210295位氨基酸为“Cyclin box” (细胞周期蛋白盒)，在 N 末端 47-55位氨基酸序列称为“destruction box (毁灭盒)， 其保守序列 RXXLXXIXN 可特异性地被泛素识别，在 M 期可通过泛素途径降 解。CyclinA 与 CDK2 结合，在 GlS 转变过程中被活化，从而调节细胞增殖。 此外，CyclinA 也与 p34 cdc2 结合，在 G2M 转变过程中与 CyclinB- p34 cdc2 复合 体一起协同作用。CyclinB 在人细胞中包括 Bl 和 B2 两种亚型。CyclinB1 由 433 个氨基酸组成，其 201-288位氨基酸序列为“Cyclin box。其 N 末端 4250位氨 基酸序列为“毁灭盒” ，在 M 期也通过泛素途径降解。CyclinB1 在 S 晚期开始 合成，在 G1M 转变过程中，CyclinB1 与 p34 cdc2 结合，通过 p34 cdc2 上 Thr14 和 Tyr15 的脱磷酸化而活化。CyclinC 由 303个氨基酸组成，其 58-136位氨基 酸为“Cyclin box” ，在其 C 末端存在一个 PEST 序列。CyclinC 可能在 G1 期起 作用，但目前尚末分离到与其相对应的 CDK。已发现的 CyclinD 家族包括 D1、D2 和 D3 三个亚型。编码人类 CyclinD1 的基因位于染色体 11q13上，全 长约 15kb，含有 5个外显子，启动子区域无 TATA 盒，但却含有转录因子 SP1 的结合位点，其表达产物由 295个氨基酸组成。在 Gl 中期，向受血清刺激的成 纤维细胞中微注射 CyclinDl 的反义质粒或抗体可抑制 CyclinD1 的功能，阻止细 胞进人 S 期，表明 D 型 Cyclin 在 GlS 转变中起重要作用。CyclinD2 和 CyclinD3 分别由 290和 292个氨基酸组成，在三类 D 型 Cyclin 中的第 56141 位氨基酸均为保守序列，称为“Cyclin box”。在 CyclinD 的 C 末端存在一个富 含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基的序列，称 为 PEST 序列，该序列在蛋白质降解过程中具有重要作用。CyclinD 的 N 末端 则含有一段与 SV40T 抗原和腺病毒 E1A 等病毒 DNA 的原癌蛋白共同的序列:河北大学2007届学年论文 6 Leu-X-Cys-x-Glu(x 为其它氨基酸残基)，该序列是与 Rb 蛋白结合的部位。 CyclinE 由 395个氨基酸组成，其中 128-215位氨基酸序列为“Cyclin box”，在 C 末端也含有一个 PEST 序列。在 Hela 细胞中 CyclinE 的量在 G1 中期上升， G1 晚期或 S 早期达到高峰;在 Gl 晚期，CyclinE 可与 CDK2 结合对于细胞顺利 进入 S 期具有重要作用。射线可使 CyclinE-CDK2 激酶活性丧失，从而阻滞 细胞周期进程。 2.1.3.2 CDKs(Cyclin-dependent Kinases) 早在 20世纪 70年代初期，Johnson 等就曾研究发现当把同步到间期不同时 期的 Hela 细胞与 M 期的 Hela 细胞相融合时，会产生早熟染色体凝集的现象， 提示着 M 期细胞中存在着一些可诱导间期细胞提前进人分裂期的因子，这种因 子被称为 M 期促发因子(M- phase promoting factor，MPF)，遍存于所有真核生 物的 M 期细胞中。同时，在以酵母为材料的研究中发现了一些与细胞周期调控 有关的基因，这些基因被称之为细胞分裂周期基因(cell division cycle gene，cdc)。 1987年，纳斯从人体中分离到与酵母 cdc2 同源的基因，并命名为 CDK，该基 因的编码产物为周期蛋白依赖性激酶蛋白家族中的一员。CDK 在进化上高度保 守，其活性调节由其它蛋白的磷酸化和去磷酸化决定，即磷酸基仅连在蛋白分 子上或从蛋白分子上脱落下来 6 ，从而使细胞沿着细胞周期顺序不断地进行分 裂。后来发现，MPF 之所以能够诱导期细胞提前进人分裂期，就是因为其具有 使多种底物蛋白磷酸化的功能，即属于蛋白激酶，现已研究证实，MPF 是由催 化亚基和调节亚基两部分所组成，其催化亚基是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (CDK) 7 。 CDK 是细胞周期运转必须的蛋白质。在单细胞真核生物中，负责细胞周期 内蛋白质磷酸化的 CDK 通常只有一种，在芽殖酵母中是 cdc28，在裂殖酵母中 是 cdc2。在多细胞真核生物中，参与细胞周期的 CDK 有多种。在人体细胞中， 控制 Gl 期的主要是 CDK2、CDK4 和 CDK6;S 期和 G2 期依赖于 CDK2;而 M 期 主要由 CDK1(相当于裂殖酵母的 CDC2)负责。对 CDK 单体及 CDK-Cyclin 复合 体的晶体结构分析表明，CDK 以单体形式存在时，其催化中心被掩盖在内部， 因而没有活性，与 Cyclin 的结合导致了 CDK 结构的变化，催化中心暴露出来， 形成了有活性的 CDK。河北大学2007届学年论文 7 2.2中心控制体系对细胞周期的调控 2.2.1 CDK 活性的调节 由于细胞周期的各个时期内有着不同的事件发生，因此作为推动细胞周期 运行的 CDK 的活性受到严格的调节。周期素(Cyclin)在不同时期中合成积累并 与相应的 CDK 结合，以调节 CDK 活性。Cyclin 作为蛋白激酶复合体的调节亚 基，对 CDKS 起着正性调节作用，即激活 CDK 的蛋白激酶活性，促进细胞周 期向前运转。在整个细胞周期中，CDK 的量保持恒定，但其调节蛋白。Cyclin 在细胞周期的不同时期中周期性地积累与分解。 在细胞周期