石蜡包埋组织切片miRNA提取试剂盒(DP502)操作指南天根生化科技（北京）有限公司天根生化科技（北京）有限公司版本号：20170524实验准备实验准备1.石蜡切片或石蜡块样本2.无水乙醇，二甲苯3.移液器及配套RNase-Free无菌枪头（200 l ，1 ml）； 1.5 ml，2.0 ml 离心管（RNase-free）4.涡旋振荡器，台式低温离心机，金属浴/水浴实验准备实验准备-试剂盒准备试剂盒准备第一次使用前应在漂洗液RW中加入无水乙醇，加入量请参见瓶上标签。在加入无水乙醇后在瓶身做好标记。Step 1 使用石蜡切片样本时，取切片（5-10 m厚，11 cm2大小）2-8张，刮取样本。注意：使用石蜡块样本时，如果样 品表面暴露于空气中, 最初的23片 弃掉不用。使用石蜡块样本时，将石蜡样品切成5-10 m厚的片状，切2-8片。迅速将切片或刮取的样本置于1.5 ml RNase-free的离心管中，加入1 ml二甲苯，剧烈涡旋10 sec。Step 2Step 312,000 rpm（13,400g ）室温离心2 min， 弃上清。注意：建议用移液枪吸除上清，不要吸到沉 淀；不要用倾倒去除上清。Step 4在上述管中加入1 ml无水乙醇，涡旋混匀10 sec。Step 5用枪头吸除上清，小心不要吸到沉淀用一个新的枪头小心吸出残余的乙醇。室温(15-25)，12000 rpm (13,400g)离心2 min。Step 6打开管盖，室温(15-25)或37放置10 min直至残余的乙醇挥发完全。 残余的乙醇会对RNA产生影响。Step 7加入150 l裂解液RF以及10 l Proteinase K于沉淀中，彻底涡旋混匀。Step 855孵育15 min之后80孵育15 min。Step 9冰上放置3 min，12,000 rpm (13,400g)离心15 min，转移上清至新的2 ml RNase-Free离心管中。Step 10加入16 l的RDD 和10 l的DNase I颠倒混匀室温放置15 minStep 11加入320 l缓冲液RB涡旋混匀Step 12加入1120 l的无水乙醇涡旋混匀(可能会出现沉淀) Step 13 and 14转移700 l溶液和沉淀入吸附柱CR3中（吸附柱放在收集管中），12,000 rpm (13,400g)离心1 min，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。Step 14 重复步骤重复步骤13直到所有溶液完全通过吸附柱CR3，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。Step 15 and 16Step 16 重复步骤重复步骤 15一次一次向吸附柱CR3中加入500 l漂洗液 RW（请先检查是否已加入乙醇）室温静置2 min，室温 12,000 rpm (13,400g)离心30-60 sec，弃废液。Step 17将吸附柱CR3放入2 ml收集管中，室温 12,000 rpm (13,400g)离心2 min，去除残余液体。吸附柱CR3室温放置2-5 min彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶 反应（酶切、PCR等）实验。Step 18将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100 l RNase-Free ddH2O，室温放置2 min，12,000 rpm (13,400g)离心2 min。洗脱缓冲液体积不应少于30 l，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70保存，以防降解。