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Western Blotting 检测人检测人 IgG作者作者 兰州大学生命学院 生物学基地班摘要摘要 本实验采用人血清为材料,对此样品进行 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后,用电转移法将蛋白质转印到硝酸纤维素薄膜上,用兔抗人 IgG 为第一抗体,用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 为第二抗体,在过氧化物酶底物存在的情况下,检测人的 IgG。关键词关键词 Western Blotting 抗体 电泳前言前言 Western Blotting 是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品,转移到固相载体上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质为抗原,与对应的第一抗体发生免疫结合反应,一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫结合反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异目的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测目的蛋白质的表达水平。正文正文 一、实验试剂,器材和材料的准备一、实验试剂,器材和材料的准备试剂试剂 (1)药品:)药品:丙烯酰胺 N,N甲叉双丙烯酰胺,四甲基乙二胺,过硫酸铵,三羟甲基氨基甲烷(Tris) ,甘氨酸,琼脂,蔗糖,溴酚蓝,十二烷基硫酸钠,甲醇,甘油,巯基乙醇,考马斯亮蓝 R-250标准分子量蛋白,冰乙醇,兔抗人 IgG,辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG,脱脂奶粉,HCL,NaCL,过氧化氢,CoCl2.(2)电极缓冲液:甘氨酸 28.2g,SDS1g,Tris6g,加水至1000ml,ph8.3.用时稀释一倍。(3)转移缓冲液:25mmol/lTris,192mmol/l 甘氨酸,20%甲醇,ph8.3(4)TBS 缓冲液:20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl,ph7.5(5)TTBS:取 100mlTBS,加 50ul Tween-20(6)封闭液及抗体稀释液:3%脱脂奶粉-TBS(7)底物溶液:2.5mg 二氨基联苯胺+9mlTBS+1ml0.3%CoCl2+10ulH2O2,临用前配置。(8)30%丙烯酰胺贮备液:29.2g 丙烯酰胺,0.8g 甲叉双丙烯酰胺,加重蒸水至 100ml。(9)浓缩胶缓冲液:0.5ml/l Tris-HCl,ph6.8(10)分离胶缓冲液:3mol/LTris-HCl,ph8.9(11)10%过硫酸铵:临用前配置(12)10%SDS(13)10%TEMED(14)1%琼脂(15)2x 样品缓冲液:0.1mol/L Tris-HCl 缓冲液,ph6.8,20%甘油,4%SDS,10%巯基乙醇,0.005%溴酚蓝。(16)低分子量标准蛋白:加 200ul 重蒸水溶解,再加 200ul2x 样品缓冲液,沸水浴加热五分钟,离心后取上清液作为标准样品。(17)考马斯亮蓝 R-250 染色液:考马斯亮蓝 R-250 0.25g,50%甲醇 454ml,冰乙酸 46ml,总体积 500ml。(18)脱色液:乙醇 6ml,冰乙酸 2ml,加水至 20ml。(19)保存液:3%乙酸。器材:器材:夹心式电泳槽,转移电泳槽,电泳仪,凝胶成像分析系统实验材料:实验材料:人血清,硝酸纤维素薄膜二、实验过程二、实验过程1.SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(1)灌胶前的准备灌胶前的准备:取两块玻璃板洗净晾干,嵌入橡胶带的凹槽中,一块略长一点的玻璃板下沿与橡胶带框底部之间留有 2-3mm 空隙,以便凝胶的一侧与电泳槽电极液相通;另一块短玻璃板的下沿嵌入橡胶框底部,两块玻璃板之间形成一个“空腔” ,然后将嵌有玻璃的橡胶凹槽装入电泳槽之间,用固定螺丝固定,在长玻璃板一侧的底部用 1%琼脂密封。(2)凝胶的配置凝胶的配置分离胶浓缩胶12430%贮备液/ml3.20.53分离胶缓冲液/ml2-浓缩胶缓冲液/ml-1.0重蒸水/ml2.662.3610%SDS/ul8040抽气十五分钟后再加入下列试剂10%TEMED/ml0.080.0410%过硫酸铵/ml0.040.02总体积/ml84.0(3)灌胶:灌胶:将配置的分离胶加入到橡胶框的“玻璃腔”内,待胶液加至距短玻璃板顶端 3cm 处时停止灌胶,然后再胶液表面上小心加入厚约 0.5cm 的水层,以保持分离胶面平整。待凝胶和水之间界面清晰时,说明胶已经聚合。聚合好的分离胶,倾去上层水,插上加样梳,将配置好的浓缩胶液加到分离胶上,直至短玻璃板的顶端。放置 30-60 分钟待其聚合。(4)加样:加样:拔出加样梳,用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。(5)电泳:电泳:调节电压至 150v 电泳。电泳完成后取出胶,切出 2 条点有样品的胶条,一条含人血清样品和分子量标准蛋白,用考马斯蓝 R250 染色液染色,1h 后,换成脱色液脱色,中间换 1-2 次脱色液至蛋白质条带清晰,再换至 3%乙醇中保存;另一仅含人血清样品的胶条用于转印和酶联免疫染色。2.转印蛋白质到硝酸纤维素薄膜上转印蛋白质到硝酸纤维素薄膜上3.膜的酶联免疫染色膜的酶联免疫染色4.对胶和膜上的显色结果照相对胶和膜上的显色结果照相5.实验结果:实验结果:胶:胶:全长a1a2a3a4a5a6a78.28cm 0.77cm 1.49cm 2.40cm 3.20cm 4.29cm 5.44cm 6.19cm膜:膜:全长全长B1B2B37.47cm0.92cm2.23cm4.12cmMr1(KDa)LgMr迁移率(迁移率(cm)标准蛋白标准蛋白 114.41.1580.748标准蛋白标准蛋白 218.41.2650.657标准蛋白标准蛋白 325.01.3980.518标准蛋白标准蛋白 435.01.5440.386标准蛋白标准蛋白 545.01.6530.290标准蛋白标准蛋白 666.21.8210.180标准蛋白标准蛋白 7116.02.0640.093以相对迁移率为横坐标,以相对迁移率为横坐标,LgMr 为纵坐标作图如下:为纵坐标作图如下:迁移率(cm)未知蛋白 10.123未知蛋白 20.298未知蛋白 30.552将未知蛋白迁移率带入上图中得: LgMr1= 1.9269 LgMr2=1.7019 LgMr3=1.3753 Mr1=84.51KDa Mr2=50.34KDa Mr3=23.73KDa所以,重联分子量是 50.34KDa,轻链的分子量是 23.73KDa。未知蛋白的分子量是 84.51KDa3、讨论讨论1.请用自己的标准曲线求出请用自己的标准曲线求出 IgG 重链的分子量。重链的分子量。重链分子量是 50.34KDa,轻链的分子量是 23.73KDa。未知蛋白的分子量是 84.51KDa2.12%的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质?的分离胶适合分离多少分子量范围的蛋白质?答:10 到 100kDa3.电极缓冲液中甘氨酸的作用电极缓冲液中甘氨酸的作用?电泳开始后,HCL 解离成氯离子,甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷,因此一起向正极移动,其中氯离子最快,甘氨酸根离子最慢,蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大,超过蛋白,因此在后面形成低电导区,而电场强度与低电导区成反比,因而产生较高的电场强度,使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动,形成以稳定的界面,使蛋白聚集在移动界面附近,浓缩成一中间层。4.不加封闭液会产生什么样的结果?不加封闭液会产生什么样的结果?用封闭液覆盖空白的 NC 膜,防止一抗与膜结合参考文献参考文献【生物化学与分子生物学实验生物化学与分子生物学实验】沈剑敏编沈剑敏编 兰州大学出版社兰州大学出版社
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