目目 录录 一. 临床细菌检验工作的基本要求和技术.1 二. 基本染色方法.2 1. 革兰染革色.2 2. 抗酸染色.2 3. 鞭毛染色.3 4. 异染颗粒染色.4 5. 墨汁荚膜染色.4 三. 葡萄球菌属（常规鉴定和试验方法）.5 四. 链球菌属 （常规鉴定和试验方法） .8 五. 肠球菌属（常规鉴定和试验方法）.13 六. 嗜血杆菌属（常规鉴定和试验方法）.14 七. 肠杆菌科 （常规鉴定和试验方法） .16 八. 弧菌属（常规鉴定和试验方法）.24 九. 气单胞菌属（常规鉴定和试验方法）.27 十. 邻单胞菌属 （常规鉴定） .28 十一. 假单胞菌属 （常规鉴定和试验方法） .29 十二. 不动杆菌属 （常规鉴定） .32 十三. 产碱杆菌属（常规鉴定）.33 十四. 消化球菌属和消化链球菌属 （常规鉴定） .34 十五. 念珠菌属 （常规鉴定和试验方法） .35 十六. 抗生素敏感试验 .38 1. 琼脂扩散法敏感试验.38 2. 琼脂稀释法敏感试验.41 3. 特殊菌的抗生素敏感试验.43 附 1. 耐甲氧西林葡萄球菌的检测.46 2. -内酰胺酶的检测.46 LIBAIWA 制作 第 1 页 共 47 页 临床细菌检验工作的基本要求和技术临床细菌检验工作的基本要求和技术 一、 对临床细菌检验人员的要求一、 对临床细菌检验人员的要求 1 负责鉴定及签发报告的主管技术人员应通晓诊断细菌学的全面知识。 2 一般细菌室工作人员均应具备细菌传染、消毒、灭菌的知识。 3 通晓细菌室守则，并严格遵守。 4 负责人应不断更新知识，了解细菌学检验的新进展。 5 定期或随时与临床医师联系，主动参与临床病例讨论，了解病情及治疗情况，达到细菌检验与临床的密切联系。 6 工作人员应定期进行健康体检及必要的预防接种，增强自身抵抗能力。 二、工作人员守则二、工作人员守则 在细菌室工作人员应注意，既不要给室内带来污染，也不要被室内的微生物感染。工作人员必须遵守以下规则： 1穿专用的工作衣、帽入室；必要时应戴口罩。 2不允许无关人员进入实验室。 3室内禁止饮食、吸烟、闲谈等非专业活动。 4养成在室内手不触及口、脸、头发及躯体的习惯。 5操作中不可说话，以免口中飞沫污染标本。 6每次完成工作和离开实验室前，应用肥皂洗手，接触了致病菌类，须用消毒剂消毒手。 7个人物品不许带入室内。 8当工作环境被细菌培养物污染，必须用适当的强消毒液泼撒覆盖污染物，并报告主管人员采取必要的措施。 9工作人员被细菌培养物污染，应用弱或中等消毒剂清洗，必要时应给予药物治疗，并向主管负责人报告，进一步采用特殊措施。 LIBAIWA 制作 第 2 页 共 47 页 基本染色方法基本染色方法 染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接在玻片 上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水 1 滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时 必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果 的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫 为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。 一、革兰染色一、革兰染色 本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色) 和革兰阴性(红色)两类。 试剂试剂 1. 结晶紫溶液 A 液： 结晶紫 2g 95乙醇 20ml B 液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml 需在用前 24h 将 A 液、B 液混合，过滤后装入试剂瓶内备用。 2碘液 碘 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完 全溶解。最后补足水量。 也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至 300ml。 3脱色液：95乙醇。 4复染液 A. 贮存液： 沙黄 2.5g 95乙醇 100ml B. 应用液： A 液 10ml 蒸馏水 90ml染色方法： 1涂片经火焰固定，加结晶紫液染 1 min，清水冲去染液。 2加碘液染 l min，水洗。 3加脱色液，不时摇动约 1030s，至无紫色脱落为止，水洗。 4加复染液，染 30s，水洗。 5干后镜检。 二、抗酸染色二、抗酸染色 抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须 掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。 奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳 性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。 抗酸染色有两种常用方法： 碱性复红法又称萋纳(ZiehlNeelsen)法。 荧光染料金胺 OLIBAIWA 制作 第 3 页 共 47 页 法(也称金胺 O-罗丹明 B 法)。 (一一) 碱性复红染色法碱性复红染色法 试试 剂剂 1萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5石炭酸溶液 90ml 2脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95乙醇 97ml 3复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10氢氧化钾 0.1ml 蒸馏水 100ml 染色方法染色方法 1涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染 5 min(若染 色奴卡菌需要加长时间)，水洗。 2加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。 3加复染液，染 0.5l min，水洗。 4干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。 *：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用 2硫酸水溶液。 (二二)金胺金胺 O-罗丹明罗丹明 B 染色法染色法 染染 剂剂 1罗丹明 B 液：罗丹明 B 0.1g 加蒸馏水 100ml； 20.1金胺 O 液：金胺 O 0.1g 加蒸馏水 95ml，再加入纯石炭酸 5ml，混匀； 33盐酸酒精； 4稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液 10ml，加蒸馏水 90ml，混匀。 方方 法法 1 涂片固定后加第 1 液 3090s。 2 弃去第 1 液后加第 2 液染 15min。 3 用第 3 液脱色 12min，水洗。 4 滴加第 4 液染 30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。 三、鞭毛染色三、鞭毛染色 用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。在细菌鉴定中，特别是非发 酵菌的鉴定中很重要。 鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻， 以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是 生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选择性培 养基，如中国蓝、麦康凯、SS 琼脂等。观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是 涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。 鞭毛染色(改良 Ryu 法) 试剂试剂 A 液： 5石炭酸 10ml 鞣酸 2g 饱和硫酸铝钾液 10ml LIBAIWA 制作 第 4 页 共 47 页 B 液： 结晶紫酒精饱和液 应用液：A 液 10 份，B 液 1 份，混合，室温存放。 染色方法染色方法 1玻片的处理：要求用新的载玻片。用前须在 95酒精中浸泡 24 小时以上。用时从酒精中取 出，以干净纱布擦干后使用。 2在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制 2 个涂片。 3用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只需点一下， 仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。 4玻片置室温自然干燥。 5滴加染液于玻片上，染色。 6约 1015min 后，用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在 玻片上，影响镜检。 7玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。寻找细菌较少的视野，鞭毛 容易观察。细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。 四、异染颗粒染色四、异染颗粒染色 用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。 标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(Albert)法染色来观察异染颗粒。 试试 剂剂 甲液： 甲苯胺蓝 0.15g 孔雀绿 0.2g 冰醋酸 1ml 95乙醇 2ml 蒸馏