拉曼光谱在生命科学领域的应用拉曼光谱在生命科学领域的应用 拉曼光谱作为一种无损、非接触的快速检测技术，已吸引广大科研人员的关注，并被应 用于各行各业中。特别是在生命科学领域，由于拉曼样品用量很少，不需要对生物样品进行 固定、脱水、包埋、切片、染色、标记等繁琐的前处理程序，不仅操作简单，而且不会损伤 样品从而能够获得样品最真实的信息。另外，生物大分子多是处在水溶液环境中，研究它们 在水溶液中的结构对于了解生物大分子的结构与性能的关系非常重要。 由于水的红外吸收很 强，因此用红外光谱研究生物体系有很大局限性，而水的拉曼散射很弱，干扰小，而且单细 胞拉曼光谱能提供细胞内核酸、蛋白质、脂质含量等大量信息，可在不损伤细胞的条件下实 时动态地监测细胞分子结构变化，可以对细胞、病毒等进行原位检测分析。 HORIBA Scientific 共焦拉曼光谱仪因其灵敏度高、性能优越而被广泛用于生命科学领 域的研究，在诸如基础研究、生物医学、药物、化妆品以及食品中都有着广泛的应用。 1. 基础研究基础研究 基础研究包括组织结构及成分鉴别（脂类、蛋白质、糖类、水、DNA，RNA 等） 、细胞 的定位、鉴别及分类等。 生物大分子中，蛋白质、核酸、磷脂等是重要的生命基础物质，研究它们的结构、构象 等化学问题以阐明生命的奥秘是当今极为重要的研究课题。拉曼是分子的“指纹图谱” ，生 物分子的指纹区主要出现在 100-2000cm-1，如图 1 左。拉曼对分子所处的环境非常敏感，结 构上的些微差异都能在拉曼谱图上体现出来，如图 1 右1。 图1 左：甲状腺肿和恶性肿瘤的拉曼谱图；右：不同肌红蛋白拉曼谱图 细胞是生命最基本的组成，是一切生命现象的基 础。共聚焦显微拉曼光谱的发展对原位活细胞研究有 着重要意义， 对于小尺寸的样品， 如尺寸仅仅为 12m 的细菌，通过真共焦的良好共焦特性，依然可以对其 进行详细研究。 如图 2 即是对细菌做的三维拉曼成像，图 2 细菌的三维拉曼成像 可以清晰地分开微小的细菌（感谢英国 CEH Oxford 的 Wei Huang 博士提供数据） 。 另外，细胞种类繁多，如细菌有不同的菌种。通常，采用一些多元统计学方法，如聚类 分析、主成分分析、判别分析等可以更好地对研究对象进行评价。图 3 是对 3 种不同的细菌 在不同生长时间下获得的拉曼结果进行的统计分析， 结果显示对于同一细菌， 尽管生长时间 不一样，但是它们都被归属于同一类，证明拉曼可以很好地鉴别不同种类的细胞。 2. 生物生物医学医学 拉曼光谱在生物组织与疾病中的研究非常广泛， 涵盖了几乎所有的软组织和硬组织， 如 脑组织、肺组织、肝组织、骨组织等。在很多空腔组织如肺、胃、结肠等中，可以将光纤包 埋在内窥镜中实现拉曼光谱的活体实时检测。 拉曼光谱可以从分子水平提供信息， 这对于很多疾病的研究有着重要的意义。 不同病变 会在拉曼谱图中有不同的特征显示， 通过拉曼光谱能够对不同疾病进行判断， 如图 4 中甲状 腺肿、腺瘤和甲状腺癌的拉曼光谱之间就有着很大的差异。 甲状腺肿甲状腺肿0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)腺瘤腺瘤0.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)甲状腺癌甲状腺癌甲状腺肿甲状腺肿0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)甲状腺肿甲状腺肿0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)腺瘤腺瘤0.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)甲状腺癌甲状腺癌0.250.200.150.100.050.00Intensity (a.u.)6008001000120014001600Wavenumber (cm-1)甲状腺癌甲状腺癌图 4 不同甲状腺病变的拉曼光谱（感谢法国兰斯大学 Manfait 教授及其同事提供的数据） 对于骨组织的愈合过程， 由于新生骨的骨胶原含量更高， 且与成熟骨存在成分上的差异， 所以拉曼可提供新生骨和成熟骨的分布，如图 5，从而可以判断骨组织的愈合程度。如果对 愈合过程的不同时间阶段进行拉曼分析，还可以对愈合过程进行实时监测。 图 3 多元分析对三种不同菌种的分类，其中 a、b、c 分别代表三种不同细菌的训练数据，而粗体的 a、b、c 代表测试数据（感谢英国 CEH Oxford 的 Wei Huang 博士提供的数据） X(um)Y(um)5 umX(um)Y(um)5 umX(um)Y(um)5 um图 5 骨组织拉曼分布，红色部分为新生骨（胶原） ，绿色部分为成熟骨（羟磷灰石+有机质)。 （感谢 Robert Fleming, University of Eindburgh 提供的数据） 3. 药物药物 在药物配方中，通常除了有效成分之外，还包含很多辅料。而原料和辅料的分布对药物 的溶解、 吸收等一系列效应有着重要影响。 根据拉曼光谱中不同成分信息的提取可以得到药 片成分分布的图像，如图 6。通过一些新的成像技术，如 SWIFTTM高速共焦光谱成像配合 DuoScan 的应用，可以在短时间内对整个药片进行成像分析。 01 0002 0003 0004 0005 0006 0007 000Y (m)02 0004 0006 0008 00010 00012 00014 00016 000 X (m)400 m400 m400 m400 m400 m图 6 药片不同成分的拉曼成像，单点采集时间为 1ms，共 48081（341141）个数据点，成像时间 535s。其中红色、绿色和蓝色分别代表阿司匹林、咖啡因和扑热息痛。 显微拉曼可以获得药片表面各成分的分布信息，而透射拉曼则能获得整个药片的平均 信息，可以对整个药片进行准确的定性、定量分析，从而能够测定不同批次或不同厂家药物 含量的均匀度、进行真假药鉴定、过程监控排错等。图 7 是使用透射拉曼结合化学计量学方 法对药片进行的定性、定量分析。其中左图样品是含 2 种不同晶型药物的胶囊，每种胶囊取 6 个样品，结果显示主成分分析法能有效区分开胶囊中晶型的差别；右图样品是 28 个含有 不同主成分含量的药片（共 7 种含量，每种含量各 4 个样品） ，使用偏最小二乘法对其进行 定量分析发现结果具有非常好的线性。 PCA plot - PC 1 vs PC 2- capsules-2,5-2-1,5-1-0,500,511,522,52525,52626,527Scores on PC 1Scores on PC 2Capsules form 1Capsules form 2Cross Validation, measured vs predictedR2 = 0,96478085909510010511011512080859095100105110115120MeasuredCross Validation Predicted图 7 透射拉曼分析结果。左图：主成分定性分析结果；右图：偏最小二乘法定量分析结果 由于拉曼光谱是无损的检测方法， 它还可以用于药物与细胞之间相互作用的研究。 如药 物与细胞作用的位点、在细胞中的分布、药物在细胞内的动力学研究等等。因此，拉曼光谱 也在药物的筛选等工作中有着广泛应用。 图 8 是药物作用于细胞后的拉曼成像结果， 其中绿 色是纯药物的分布位置，紫色、蓝色和粉色分别是药物作用于细胞膜、细胞质和 DNA 形成 复合物后的成分分布图。最后一张是所有成分分布的叠加。 图 8 药物与细胞的相互作用分布图，前 4 张图从左到右分别是纯药物、药物与细胞膜、与细胞质、与 DNA形成复合物的分布图，第 5 张是前 4 张图的叠加。 4. 化妆品化妆品 大部分化妆品是直接和人体接触的， 它们的安全性以及效果备受人们关注， 无损的实时 检测更是对此行业有着重要意义。 由于拉曼光谱无侵入无损伤， 可直接对志愿者的皮肤进行检测研究， 能够实时的监测产 品效果。通过共聚焦拉曼光谱仪可以对皮肤含水量进行深度分析，如图 9 所示，在不同深度 处皮肤的含水量不同， 并且在涂抹保湿霜后在不同深度有不同的变化。 由此可以判断保湿霜 的效果。 染发护发产品的穿透效果深受各大品牌关注。 将拉曼光谱应用于产品作用于头发的 效果研究，可以通过产品的特征谱带追踪产品的穿透深度，从而对产品的效果进行判断。 2 m 药物药物 细胞膜和细胞器细胞膜和细胞器 极性细胞质极性细胞质 药物药物-DNA 复合物复合物 各成分叠加图 Surface: 0m 20m OH/waterCH2/proteinSurface: 0m 20m OH/waterCH2/protein图9 A皮肤不同深度的水的拉曼光谱；B产品在头发中的穿透深度。 （感谢欧莱雅提供的数据） 此外，很多化妆品都是乳液，其乳滴的稳定性、有效成分在乳滴中分布的均匀性等都是 影响化妆品质量的重要因素。 拉曼成像可以获得化妆品乳液中颗粒或相态分布、 乳滴中的成 分分布等信息，如图 10，从而在化妆品的研发和质量控制中有着重要的作用。 -25-20-15-10-50510152025Y (um)-30-20-1001020 X (um)2 祄-12-10-8-6-4-202468101214161820Y (um)-15-10-5051015 X (um)0.400.420.440.460.480.500.520.540.560.580.600.620.640.660.680.700.72Intensity (cnt)1 祄1 祄1 祄-1001020祄X ()-1001020祄Y ()0Intensity (counts)图 10 化妆品乳液拉曼成像（感谢某知名化妆品品牌提供的数据） 5. 食品食品 苏丹红、三聚氰胺、瘦肉精等一系列事件迫使人们 越来越关注食品安全这个与健康密切联系的议题。拉曼 光谱作为一种无需样品前处理、灵敏度相对较高、分析 测试快速便捷的绿色光谱技术，对于食品质量检测2、 食品中细菌鉴别3及食品加工4等都有重要应用。 很多同类食品的结构非常相似，如食用油都是脂肪 酸，但是动物食用油主要是饱和脂肪酸，而植物油主要 是不饱和脂肪酸。对于这些结构相似的化合物，使用化 学计量学方法可以有效地将它们区分开， 如图 11 中的硬 脂酸甘油酯，1#样品含不饱和脂肪酸甘油酯，而 2#样品 是饱和脂肪酸甘油酯，两种样品各取 6 个点，经主成分 分析法归类后发现，拉曼可以区分开这两种非常相近的 样品。 2007 年美国发生多起猫、狗宠物中毒死亡事件，经拉曼研究分析发现猫粮中的三聚氰 胺和三聚氰酸可以在肾组织中形成复合物晶体，阻塞肾小管内腔，量多严重者可致死。图 12 是猫服用三聚氰胺、 三聚氰酸添加猫粮后在肾中形成复合物晶体的拉曼分析结果5， A 是 猫肾显微图像， B 是肾中形成的结晶， 其中黑色框是拉曼成像位置， C 是成像区域的拉曼图， D 是伪彩色显示的拉曼强度分布图，E、F 是体外模拟实验得到的复合物拉曼谱图和显微图。1# 2# 图