SOOCHOW UNIVERSITY硕 士 学 位 论 文论 文 题 目 蓝 萼 甲 素 抑 制 血 小 板 活 性和 血 栓 形 成 的 机 制 研 究研 究 生 姓 名 李 威指导教师姓名 朱 力专 业 名 称 药 理 学研 究 方 向 心 血 管 药 理论文提交日期 2013 年 4 月蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的机制研究 摘 要摘 要血 小 板 在 动 脉 粥 样 硬 化 以 及 各 种 血 栓 栓 塞 等 心 脑 血 管 疾 病 中 发 挥 了 举 足 轻 重的 作 用 。 研 究 证 明 抗 血 小 板 药 物 能 够 用 来 预 防 及 治 疗 各 种 血 栓 栓 塞 的 急 性 临 床 事件 。 而 草 药 成 分 被 认 为 是 开 发 抗 血 小 板 药 物 的 重 要 来 源 。 蓝 萼 甲 素 （ glaucocalyxinA， GLA ） 是 从 唇 科 香 茶 菜 属 植 物 香 茶 菜 Isodon japonica （ Burrm F） Hara varglaucocalyx (Maxim) Hara 中 提 取 分 离 出 的 一 个 二 萜 化 合 物 。 蓝 萼 香 茶 菜 为 民 间 药 ，性 味 苦 、 寒 ， 具 有 健 胃 、 清 热 解 毒 、 活 血 、 抗 菌 消 炎 等 活 性 。 现 代 药 理 研 究 表 明 ，蓝 萼 香 茶 菜 的 乙 醇 提 取 液 能 减 轻 心 肌 缺 血 -再 灌 注 损 伤 ， 保 护 心 肌 ； GLA 可 以 通 过抗 血 小 板 作 用 起 到 活 血 、 心 肌 保 护 作 用 ， 如 可 抑 制 卡 西 霉 素 刺 激 的 兔 血 小 板 生 成血 小 板 活 化 因 子 ， 能 抑 制 花 生 四 烯 酸 诱 导 的 兔 血 小 板 血 栓 素 A2 生 成 ， 并 同 时 升 高前 列 腺 素 E2， 能 显 著 抑 制 ADP、 AA 和 PAF 等诱导的兔血小板聚集，显著升高血小 板 内 cAMP 水 平 ， 能 增 加 机 体 对 86Rb 的吸收，改善微循环作用。最新研究发现GLA 还 能 通 过 线 粒 体 途 径 诱 导 癌 细 胞 凋 亡 。 因 此 ， 本 论 文 我 们 进 一 步 证 明 了 GLA具 有 抗 血 小 板 作 用 ， 并 阐 明 了 GLA 抑制血小板活化的分子机制。利 用 新 鲜 分 离 的 健 康 志 愿 者 提 供 的 外 周 血 ， 我 们 制 备 了 洗 涤 血 小 板 用 于 检 测GLA 对 血 小 板 活 化 的 影 响 。 血 小 板 聚 集 实 验 结 果 显 示 ， GLA 在浓度为 0.001g/ml与 0.01g/ml 时就能显著抑制胶原诱导的血小板聚集（P 0.001 和 P 0.001） ，而对 其 他 血 小 板 刺 激 剂 ， 诸 如 ADP、 thrombin、 U46619（ TXA2 模 拟 物 ） 刺 激 的 血小 板 聚 集 无 抑 制 作 用 ， 提 示 GLA 对 胶 原 诱 导 的 血 小 板 聚 集 具 有 一 定 的 选 择 性 、 专一 性 。 提 示 GLA 主要是通过作用于血小板表面糖蛋白受体 GP通路来起到抑制血 小 板 聚 集 的 作 用 的 。为 进 一 步 从 细 胞 以 及 分 子 水 平 探 讨 GLA 对 血 小 板 活 性 影 响 的 机 制 ， 本 论 文 研究 了 GLA 对血小板活化信号通路的影响。胶原蛋白与 GP 结 合 后 ， 可 引 起 Src家 族 信 号 蛋 白 向 GP 胞 内 部 位 募 集 并 磷 酸 化 ， 磷 酸 化 后 的 Src 可 与 GP 胞 内 部位 协 同 作 用 ， 导 致 Syk 的 磷 酸 化 进 而 活 化 PLC 2； 通 过 一 系 列 信 号 传 递 ， 血 小 板活化并可发生形变、黏附、释放。胶原蛋白受体 GP信号传导途径的 Src、 Syk和 PLC2 酪 氨 酸 磷 酸 化 的 抑 制 作 用 。I摘 要 蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的机制研究研 究 还 发 现 GLA 能 够 降 低 胶 原 蛋 白 刺 激 的 AKT, ERK 和 p38 磷 酸 化 ； 由 于AKT 是 PI3K 通 路 的 标 志 ， ERK 和 p38 是 MAPK 通 路 的 信 号 蛋 白 ， 所 以 我 们 认 为GLA 也 能 够 抑 制 PI3K 通 路 和 MAPK 通路。流体小室实验能够在体外模拟体内血管 壁 损 伤 导 致 胶 原 蛋 白 暴 露 ， 血 小 板 黏 附 在 损 伤 部 位 ， 形 成 血 栓 的 病 理 生 理 过 程 。在 本 论 文 的 第 四 章 ， 通 过 流 体 小 室 实 验 ， 证 明 蓝 萼 甲 素 （ GLA） 能 够 抑 制 血 小 板粘 附 于 胶 原 蛋 白 的 表 面 。此 外 ， 我 们 通 过 凝 血 酶 （ thrombin） 和 蛇 毒 素 (convulxin, CVX)诱 导 的 p-selectin分 泌 (P0.01) 和 Pac-1 结 合 实 验 (P0.01)， 证 明 GLA 在 浓 度 为 0.5g/ml 时 能 够抑 制 血 小 板 由 内 向 外 的 信 号 传 导 。 我 们 还 通 过 凝 收 缩 块 （ clot retraction） 实 验 ， 证明 了 GLA 能够抑制血小板活化过程中由外向内的信号传导。总 之 ， 本 论 文 初 步 阐 明 了 GLA 能够通过影响血小板糖蛋白 VI 信 号 通 路 抑 制血 小 板 活 化 的 分 子 基 础 。 为 开 发 GLA 作 为 一 种 新 的 抗 血 小 板 药 物 ， 提 供 了 有 价 值的 实 验 依 据 。关 键 词 :蓝 萼 甲 素 ； 抗 血 小 板 聚 集 ； 分 子 机 制 ， 信 号 通 路作 者 ： 李 威指 导 教 师 ： 朱 力II蓝萼甲素抑制血小板活性和血栓形成的机制研究 英文摘要Glacocalyxin A inhibits platelet activation andthrombus formation via GPVI pathwayAbstractPlatelets play a pivotal role in thrombosis， and antiplatelet agents has been provento be useful in preventing acute clinical events of thrombosis. Ingredients from herbsare important sources to develop antiplatelet agents. Here we report the antiplateleteffect of glaucocalyxin A (GLA) and investigate the molecular mechanisms throughwhich GLA inhibits platelet activation.GLA was isolated and purified from Rabdosia japonicavar, and its effect onplatelet activation was tested using washed platelets freshly isolated from peripheralblood of healthy donors. Results showed that pretreatment of human platelets with GLA(0.01g/ml, 0.1g/ml) significantly inhibited platelet aggregation induced by collagen(P0.001 and P 0.001, respectively). The inhibition also occurs in otheragonist-induced platelet aggregation when platelets were pre-incubated with higherdoses of GLA (5g/ml, 50g/ml). Platelet inside-out signaling was inhibited by GLA asindicated by p-selectin secretion (P0.001) and Pac-1 binding assay (P0.001). GLAinhibited platelet adhesion on collagen surfaces .Further study showed that GLA inhibited collagen-stimulated tyrosinephosphorylation of SRC, SYK and phospholipase C2, the signaling events in collagenreceptor GP pathway. GLA was also found to inhibited PI3K and MAPKS, as shownby reduced AKT, ERK and p38 phosphorylation. Finally, GLA inhibited platelet clotretraction, a process mediated by outside-in signaling.The present results provide a molecular basis for the inhibition by GLA ofcollagen-stimulated platelet activation. Our data suggest that GLA may be developed asa novel therapeutic agent for the prevention of thrombotic disorders.Key words： Glaucocalyxin A； antiplatelet aggregation； molecularmechanisms； signaling patywayWritten by Wei LiSupervised by Li ZhuIII目录前 言 . 1第 一 章 蓝 萼 甲 素 对 血 小 板 聚 集 的 影 响 . 31、 前 言 . 32、 实 验 材 料 .