凯基实时荧光定量凯基实时荧光定量PCR端粒酶端粒酶（人）（人）检测试剂盒检测试剂盒 修订日期：修订日期：20140711 Cat Number：KGA1028H-KGA1029H Store at -20 for 12 months，避光 For Research Use Only 一、一、 试剂盒说明试剂盒说明 产品概述：产品概述： 端粒是真核生物染色体末端特殊的 DNA-蛋白结构，含多个重复序列（5-TTAGGG-3） ，端粒结构的形成和功能的维持需要端粒结合蛋白的直接或间接参与。端粒酶是细胞体内一种核糖核蛋白复合体，是由 RNA 和蛋白质亚基组成的一种特殊的逆转录酶，其可以利用自身的 RNA 模板合成末端 DNA，并添加到染色体末端以克服末端序列的丢失，从而使细胞获得增殖能力。 端粒酶蛋白催化亚基（TERT 或 TRT）具有反转录酶的主要特征，其表达在正常细胞中受到抑制，研究表明，TERT或 TRT 的表达与端粒酶活性的表达一致， 与端粒酶的活化程度密切相关。 Wisman 等在人卵巢癌中利用逆转录 PCR 检测hTERT 的 mRNA 的表达，并采用 TRAP 法检测端粒酶活性，结果证实二者均存在于恶性肿瘤中并且表达模式相同。基于上述原理，凯基实时荧光定量 PCR 端粒酶检测试剂盒通过检测 TERT 的 mRNA 表达水平来间接反应端粒酶的活性。 实时荧光定量 PCR（SYBR Green Real-time PCR）方法以其卓越的快速性及定量性被广泛应用于科研领域，使用本试剂盒可以准确简便地进行 mRNA 的表达分析。试剂盒采用 SYBR Green qPCR Master Mix 为荧光实时定量 PCR 和Two-Step 荧光实时定量 PCR 设计的最优反应体系，并结合特异性的细胞端粒酶催化亚基基因 TERT 引物，简化实验步骤和提高实验效率。Master Mix 含有 Maxima Hot Start Taq DNA 聚合酶、dNTPS、进行优化处理的 PCR 反应缓冲液以及 SYBR Green 染料。使用 Hot Start Taq DNA 聚合酶，为 PCR 反应提供了更高的产量和灵敏度、特异性，能够检测低至 10 个拷贝的目的基因。 本试剂盒可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对细胞基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。只需加入样品 DNA 模板，反应即可进行。 备注：由于对端粒酶进行检测的所有方法都不能完全定量备注：由于对端粒酶进行检测的所有方法都不能完全定量的检测细胞端粒酶的活性，同时的检测细胞端粒酶的活性，同时 TERT 基因或者蛋白的表基因或者蛋白的表达与端粒酶之间的间接关系准确性有待于进一步研究，望客户根据实际选择使用。达与端粒酶之间的间接关系准确性有待于进一步研究，望客户根据实际选择使用。 产品应用：产品应用： 适应于大多数的 Real-time PCR 扩增仪，包括 Applied Biosystems，Eppendorf，Corbett，Bio-Rad，Roche，杭州博日（Line-GeneBioer）等品牌的 PCR 扩增仪。 二、二、 试剂盒组份试剂盒组份 组份名称组份名称 KGA1028 20 tests KGA1029 50 tests 保存条件保存条件 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2） 250L 700L -20，避光 Water, nuclease-free 300L 800L Human TERT primer（10M） 50L2 130L2 GAPDH-F Primer（10M） 30L 70L GAPDH-R Primer（10M） 30L 70L 三、三、 操作步骤操作步骤 样本的处理：样本的处理： 1. 提取样本 RNA，并进行逆转录获得 cDNA（参考凯基 RNA 提取以及逆转录试剂盒） 2. 将试剂盒中的组分溶解后，轻轻混匀并低速离心。 3. 进行 25L 体系的实时定量 PCR 请参考以下表格（DNA 模板下一步中添加） ： 该体系中含有的 MgCl2终浓度为 2.5mM。 大多数体系中引物终浓度为 0.3M 可以得到好的实验结果，如有调整，建议引物的最终浓度范围在 0.05M到 0.9M。 如果体系特殊要求，可以按照该体系进行调整。 4. 将以上各组分（除 DNA 模板外）添加并混匀，加入至 PCR 反应管或反应板终。 5. 添加 DNA 模板（500ng/反应）到第 3 步骤中准备好的 PCR 反应管或 PCR 板中。 备注：在两步法实时定量 PCR 中，加入的 cDNA 模板的体积不能超过反应总体积的 10% 6. 轻轻的混匀 PCR 管中的各组分，避免产生气泡，如需要，可进行低速离心。如果有气泡的存在会影响荧光强度的收集。 7. 参照一下说明设置实时定量 PCR 循环仪，放入样品并启动程序。 （如有需要，可以根据仪器本身特点进行调整） 循环参数设置：循环参数设置： 循环反应可以采用三步法或两步法进行实验，参考数据如下： 1. 三步法循环参数设置： 阶段阶段 温度（温度（） 时间时间 循环数循环数 （可选）UDG 预处理 50 2min 1 总变性 95 10min 1 变性 95 15s 40 复性 60 30s 延伸 72 30s 备注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段 2. 两步法循环参数设置 阶段阶段 温度（温度（） 时间时间 循环数循环数 （可选）UDG 预处理 50 2min 1 总变性 95 10min 1 变性 95 15s 40 复性/延伸 60 60s 备注：荧光信号的收集和处理是在延伸阶段 四、数据的处理四、数据的处理 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix（2） 12.5L TERT Forward Primer（10M） 0.8-1.0M TERT Reverse Primer（10M） 0.8-1.0M Template DNA 500ng Water. Nuclease-free to 25L Total volume 25L 1、对获得的数据进行分析处理。 可选步骤：可选步骤： 1. UDG 预处理：如需减少 PCR 产物的污染，可以于总变性前用 UDG 预处理 2min。 2. 熔解曲线分析：可用于验证引物设计的特异性以及鉴定 PCR 产物。如果引物设计不够优化，可能会产生部分的引物二聚体，这些引物二聚体可以通过熔解曲线观测到。 3. PCR 产物的琼脂糖电泳：可以通过琼脂糖电泳的方式对 PCR 产物进行进一步的验证。 备注备注： 1. 建议采用 25L 的实验体系，如果改变请参照其余说明进行调整。 2. 主反应混合液 Master mix 含有除模板、引物外的全部组分，避免其反复冻融和污染是进行一个成功实时定量PCR 反应的重要步骤。 3. PCR 扩增仪设定时需要建立起始 10 分钟、95的变性程序以激活 Maxima Hot Start DNA 聚合酶。 4. 一般实时定量实验中采用适宜体系确保 Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 的最小化，避免产生大量的荧光强度。 5. 针对不同实验条件和仪器型号重新调整荧光阈值。 6. 当使用 Bio-Rad 的 iCycler iQ 或 MyiQ system 时请按照仪器生产商的说明进行实验。 五、注意事项五、注意事项 模板模板 1. DNA：25L 的 Maxima SYBR Green 实验体系中的基因组以及质粒 DNA 浓度最多为 500ng 2. RNA： 实时定量 PCR 体系中的 RNA 模板要求 RNA 模板没有基因组 DNA 的污染， 我们建议使用 Dnase 来消除痕量的基因组 DNA 的污染；在两步法实验体系中，最多 5g 的总 RNA 用于 cDNA 的反转录合成，经反转录完毕后的 cDNA 模板总体系不应该超过实时定量 PCR 总体系的 10%。 必要的实验控制必要的实验控制 阴性对照阴性对照（NTC） ：No template control 反应是加入除模板 DNA 以外所有成分的阴性对照，可以避免或检测试剂中是否存在基因组 DNA 的污染、引物二聚体的产生。 RT Minus 阴性对照阴性对照：Reverse Transcriptase Minus control 反应是指加入除 RT 反转录酶制剂以外的全部组分，可以来检测 RNA 样本中是否含有基因组 DNA 的污染。 六、常见问题分析六、常见问题分析 问题 可能原因以及解决方案 没有扩增曲线，琼脂糖电泳检测不到 PCR 产物 体系中混入了体系中混入了 PCR 反应的抑制剂反应的抑制剂 重新纯化或提取基因组 DNA 引物发生降解引物发生降解 对引物降解进行分析 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 中加入的逆转录产物过量中加入的逆转录产物过量 实时荧光定量 PCR 中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的10% 加样错误或者没有添加某一组分加样错误或者没有添加某一组分 重新进行实验，确认添加模板或引物的浓度；确认试剂存放的温度条件，注意加样完全。 引物的降解引物的降解 可以采用聚丙烯酰胺电泳对引物进行验证，如有问题重新合成引物。 复性温度不合理复性温度不合理 优化复性温度，可以采用常规 PCR 进行摸索和分析 UDG 预处理的条件下，复性温度过低预处理的条件下，复性温度过低 进过 UDG 处理后，PCR 反应的复性温度应该高于 55，如果复性温度必须要低于 55，建议采用 Heat-labile UDG 没有获得扩增曲线，但是经琼脂糖电泳可以检测到PCR 产物 实时荧光定量实时荧光定量 PCR 仪器设置错误仪器设置错误 检测仪器检测参数是否正确（荧光染料的选择，荧光检测参数的设置等） 没有激活荧光检测装置没有激活荧光检测装置 激活荧光检测装置，设置于复性/延伸阶段或者延伸阶段收集荧光信号 PCR 仪器错误仪器错误 参考仪器说明书解决仪器问题 无模板阴性对照获得扩增荧光信号 试剂中存在试剂中存在 DNA 污染污染 参考常规消除 DNA 污染的方法对模板进行处理 更换新的 PCR 试剂 RNA 样本中存在基因组样本中存在基因组 DNA 的污染的污染 设计含有内含子的扩增引物；对污染的 RNA 样本使用 DNase 处理，确保反转录实验没有 DNA 的污染 PCR 效率超过 110% 非特异性产物： 使用熔解曲线或琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物分析，鉴定 PCR 产物的特异性；优化产物并重新设计引物。 PCR 效率低于 90% 体系中存在体系中存在 PCR 抑制剂：抑制剂： 重新纯化 DNA 模板 PCR 反应条件不合适反应条件不合适 确认试剂的存放条件，确认引物浓度 引物设计不合理引物设计不合理 验证引物的扩增效率，避免产生错配以及二聚体 标准曲线不佳 DNA 模板的浓度过大模板的浓度过大 建议 25L 的反应体系中 DNA 的最大量为 500ng 模板质量较差模板质量较差 如果可能，提高 DNA 模板的质量 添加的逆转录反应产物过量导致抑制作用添加的逆转录反应产物过量导致抑制作用 实时定量 PCR 中加入的逆转录反应产物的体积不要超过总反应体积的 10%。 荧光强度不一致（重复性较差） 实时荧光定量 PCR 循环仪存在污染 根据仪器厂商说明清理仪器，减少影响实验的污染因素 PCR 循环仪校准较差 根据仪器厂商说明调整仪器