PCR 技术及其应用实例和前景检验 0905 郭媛媛PCR 是我们研究 分子生物学的重要方法和工具，随着医学科技的不断发展，这种技术越来越被人们看重，越来越多的应用到我们的科技研究之中，作为医学检验工作者，这种技术也是我们必须掌握的从这篇文章中让我们了解一下它在实践之中的前景。摘要：PCR (ploymerse chain reaction)技术1，即聚合酶链反应技术，又称基因体外扩增技术或和核酸体外扩增技术，利用两种与相反链杂交并利用附着于目标 DNA 两端的寡核苷酸引物在高温(95C)使目标 DNA 片断的 DNA 双链变性，分解为单链，在较低温度(37-63C)与引物退火，然后变温到 72C 左右。在耐高温 DNA 聚合物酶的作用下引物被沿样板 DNA 单链延伸合成互补链，然后有变性退火延伸反复进行。引物大大过量，dNTP 过量，酶在高温中是较稳定的，这样经过几十个循环，目标 DNA 片断就按 2 的 n 次方递增，用此法可以从mRNA 中，cDNA 库中扩出目标基因。总之，生物体内核酸的复制是半保留复制，PCR 技术就是在体外对此进行复制模拟。关键词：PCR 技术；DNA；应用；工程效益扩大1 1 引言引言人类利用微生物的实践具有悠久的历史，公元前，人类就已经利用天然的微生物（酶）生产奶酪和酒。进入工业革命时代，人们开始对天然微生物进行筛选和诱变，生产某些简单的代谢产物，氨基酸，维生素和抗生素。20 世纪 60 年代至今，随着人类虽微生物认识的加深，DNA 重组技术的出现，发酵技术的提高：更多的微生物可产生各种各样的抗生素，应用于医学微生物学(Medical Microbiology)中；更多微生物被发现可产生促生物质，有利于人和动植物的生长，对农业科学(Agriculture)有着极重要的支持；还有些微生物的代谢产物是重要的化工原料，加速了化工产业(Chemical Industry)的完善；再有些微生物被广泛应用于法医鉴定(Forenic)、医学(Medical Science)、环境监测(Environment Supervise)分子克隆(Member Clone)、序列分析(Alignment Analysis)、考古研究(Archaeology Search)等重要学科，具有广泛的应用前景，这就是我要介绍的 PCR 技术。2 2 PCRPCR 技术原理技术原理下面我通过摘录了一个实验2，来介绍一下 PCR 技术的过程及其原理(至于它详细的实验过程和方法详见参考文献)。.在 94C 高温下双链变性，分离出 DNA 单链的模板，然后降温(55C)，然添加的与 DNA 单链配对，紧接着温度升高(72C)，在 DNA 聚合酶的作用下，脱氧核苷三磷酸开始渗入，并从引物的结合端开始，按 5-3方向延伸，合成出新生的 DNA 互补链，这一过程称为一循环，然后重复该循环，模板 DNA 被大量复制。在此，我要特别强调几点注意事项，这也是这个实验设计者提醒我们需要注意的地方：(1) 在配置 PCR 反映体系的过程中，Taq 酶应在加入 dNTP 混合物后加入，因为有些酶的 3-5的外切酶反应较强，反映体系如果不含 dNTP，反应体系中的引物可能被分解。(2) 非特异性扩增产物，可能是模板有与引物同源性高的其他位点，其次是复性温度太低，适当提高复性温度就可以解决这些问题。以上实验可清楚明了地向我们展示 PCR 技术的原理。 3 3 PCRPCR 技术分类技术分类PCR 技术自从 1985 年由 Millus 创立后，经历了 20 年的飞速发展，是传统微生物学与现代基因学之间的完美结晶，已成为当今世界上不可或缺的一项重要的微生物应用技术，下面我将介绍几种常用的 PCR 技术33.1 反转录 PCR反转录 PCR(reverse transcription PCR, RT-PCR)即以 RNA 分子为模板的扩增技术，主要用于克隆 cDNA、检测 RNA 病毒、合成 cDNA 探针机构建 RNA 高效转录系统。3.2 定量 PCR定量 PCR(quantitative PCR)的基本原理是。假定其反应产物的数量同反映混合物中起始模板的 mRNA 或 DNA 的量成正比，因此通过琼脂糖电泳样品条带得比较，便可以确定两种 PCR 产物之间的数量关系。另外定量 PCR 还有广义和狭义之分4，在此就不详细介绍了。3.3 实时荧光定量 PCR所谓实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR)技术，是指在 PCR反应体系中加入荧光基团，利用映光信号积累实时监测整个 PCR 进程，最后通过校正曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，还具有特异性更强、有效解决了 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。3.4 重组 PCR重组 PCR(recombinant PCR RP-PCR)是指用 PCR 法在 DNA 片段上进行点突变，即扩增产物中含有域模板序列不同的碱基。利用重组 PCR 可造成 DNA 片段的碱基插入或缺失，从而研究目的基因片段的功能。3.5 反向 PCR反向 PCR(inverse PCR IP-CR)是对一个已知的 DNA 片断序列两侧的未知序列进行扩增和研究的技术。3.6 多重 PCR多重 PCR(multiplex PCR)即在同一反应体系中加入多对引物，扩增同一模板的几个区域。多重 PCR 可同时检测多个突变位点或病原生物，有利于遗传病和感染性疾病的诊断。3.7 不对称 PCR不对称 PCR(asymmetric PCR)即在扩增体系中加入不同浓度的引物，而得到单链 DNA 产物。另外还有几种新型的、最近兴起的 PCR 技术5，虽不十分成熟，但发展前景十分广阔。它们包括：3.8 原位 PCR原位 PCR 是指对组织细胞中特异 DNA 或 RNA 进行 PCR 扩增，然后再用原位PCR 进行扩增，然后再用原位杂交对扩增产物进行定量分析的一种方法。目前有报道6用这种方法可检测出组织细胞中的人乳头瘤病毒、艾滋病毒、结核杆菌等。3.9 巢式 PCR巢式 PCR 比常规 PCR 灵敏度大大提高，同时第二次扩增又可鉴定第一次扩增产物的特异性。所以这种方法用于临床检验，目前血清中丙型肝炎的监测多用这种方法。4.4. PCRPCR 技术应用实例技术应用实例PCR 技术自从建立以来，由于其敏感、高效、操作简便，在分子生物学研究、临床医学和其他很多领域中得到了广泛应用。4.1 分子生物学理论研究7如：制备 cDNA 文库与筛选，既费钱费时，又需要较多的组织。但如果用 PCR 技术，只要很少组织甚至几个细胞就可以构建 cDNA 文库，并且大大提高了工作效率。再如：DNA 测序、检测突变碱基、基因重组与融合、用简并引物法扩增未知序列，无不是 PCR 技术在分子生物学中的应用。4.2 临床医学8如：病原体诊断，利用 PCR 技术可以检测标本中的病毒、细菌、支原体，直至寄生虫等病原生物，标本可以是组织、血液、细胞、分泌物、排泄物等。以后还发展了遗传病基因的诊断、组织器官移植的配型选择、肿瘤的诊断转移和确定、法医学和其他临床医学领域。4.3 考古学9由于 PCR 技术对基因组的完整性要求不高，因而对分子考古学极为有帮助，科判定生物种类间的亲缘关系、进化途径等。如：1997 年德国慕尼黑大学动物研究所科学家宣称10，他们对欧洲原始人欧洲尼安德特人化石中的基因残余物进行分析，结果表示著名的欧洲原始人尼安德特人不是欧洲现代人的祖先，这一结果又得到了英国、俄罗斯和瑞典科学家的进一步证实，为现代人的起源提供了新的论据。4.4 其他领域PCR 技术还在动植物研究领域、组织和群体生物学等领域已得到了广泛的应用11。5.5. 前景与总结前景与总结结合对以上 PCR 技术的了解，我认为 PCR 技术可以加快实现它的工程化，效益化，如：应用在现代环境工程污水处理工程的微生物载体研究上12，PCR技术暂时只是致力于理论方面和研究方面，它并没有像其他微生物技术那样给人类社会带来大规模的经济效益，假如可以实现这一设想，那么不但 PCR 技术本身可以得到更加快速的发展，而且我们还可以促进经济的发展。比如说：在传统的生物发酵技术上可以结合 PCR 技术，利用 DNA 在体外的复制和杂交，并实现表达，可以实现基因工程的超远缘杂交的物种突破难进行的问题；再比如：可以通过 PCR 技术实现核酸杂交技术，核酸杂交法比抗原捕获特异、敏感，但半衰期短，放射性污染不易处理，显影时间长等缺点，目前国内外常用的生物素检测标本中致癌物质13。另外，还有很多微生物的 PCR 技术在工程上的应用，这里就不一一列举了。关键是怎样扩大在工程上的应用，以扩大经济效益。这是 PCR 技术的关键。PCR 技术运用传统生物技术结合近代基因工程原理，包含反转录 PCR 技术、定量 PCR 技术、实时荧光定量 PCR 技术、重组 PCR 技术、反向 PCR 技术、多重PCR 技术、不对称 PCR 技术等多种传统 PCR 技术和原位 PCR 技术、巢式 PCR 技术等一系列新兴 PCR 技术。最新的进展如14：结核杆菌诊断 PCR；病毒学 PCR技术；HIV 感染 PCR；检测人 COX 病；DMS/BMD 基因；地中海贫血 PCR；血友病A 基因在工业在分子生物学、临床医学、考古学等众多领域取得了巨大成就，不但只是局限于研究领域，而且还从实用角度证明了 PCR 技术是一项令人类值得自傲的技术。自从 1985 年由 Millus 创立之后，又得到了近二十年的发展，所以 PCR 技术的发展前景是不可估量的。它绝对是现代生物学技术中一项值得发展的技术，在当今社会乃至未来社会都会有它的立足之地，充分运用它，人类会在文明发展的进程中，发出更耀眼的光芒。参考文献：参考文献：1 欧阳平凯,生物科技辞典,化学工业出版社,北京,2003.10:3422 赵斌,何怡红,微生物实验,科学出版社,北京,2002,23(5):11-153 孙汶生,黄英才,马曹红等,基因工程学,科学出版社,北京,2004.8:131-1364 魏平著,关于定量 PCR 技术,科学教育出版社,北京,2001.815:595 贺淹才,简明基因工程原理(第二版),科学出版社,北京,2005,8:175-1976 俞华,PCR 技术发展及应用前景,人民日报,2003.12(5),第 7 版7 马中声等,分子生物学,教育出版社,北京,2004,7:1358 陆德如等,现代生物医学技术,化学工业出版社,北京,2002,7:50-529 李立家,PCR 技术的应用及前景,东北大学学报,2002,11:10-1510 Geoger White, Prospective of PCR Technology, Science,2000,5(7):29-3211 Michael Brand, Methods in Molecular Medicine, Vol.26“Quantitative PCR Protocols” Edited by: B.kochanowski and V. Reischi, Humana press Inc. Totowa, NJ, 199912 李彦春,关于废水处理的现代技术应用,环境技术通报,2005,5(4):25-3013 二雄吉平,吴涛译,关于 PCR 技术的一些看法,东京大学学报现代基因技术译丛, 2004,11(4):10-15 14 Tess. M. Jission etc. Toward routine diagnosis of hepatitis B virus desoxyribonucleic acid. Clinical Bioc