基质金属蛋白酶（基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）明胶酶谱法电泳分析试剂盒产品说明书（中文版）主要用途主要用途 基质金属蛋白酶（MMP）明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析试剂是一种旨在通过明胶聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法，在分离、蛋白复性、底物水解、染色等一系列步骤下，观察并半定量深蓝色背景中的无色清晰的基质金属蛋白酶条带，根据分子量确定特异基质金属蛋白酶及其活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞萃取样品（动物、人体、植物、昆虫等） 、培养上清悬液、血清和关节滑液或脑脊液等基质金属蛋白酶-2，9，以及 13 等活性及其抑制剂的检测。产品即到即用，性能稳定，操作便捷，敏感度高，条带清晰，重复性好。 技术背景技术背景 基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases；MMPs）是一类结构高度同源的分泌型或膜相关性锌内肽酶的总称，因含有金属（锌、钙）离子而得名。其功能在于分解细胞外基质成分。迄今为止发现的MMPs至少有 28 种，几乎能降解除多糖以外的全部细胞外基质（extracellular matrix）成分，同时参与胚胎发育、形态形成、胚泡植入（blastocyst） 、血管形成、组织再吸收（tissue resorption） 、疾病发生，例如关节炎、癌细胞浸入转移等。根据降解的底物不同可将MMPs分为 4 大类： （1）胶原酶：MMP1、MMP8、MMP13 主要消化、型胶原和蛋白多糖； （2）明胶酶（型胶原酶） ：MMP2、MMP9，又称明胶酶A、B，主要消化、型胶原和弹性纤维； （3）基质溶解素：MMP3、MMP7、MMP16、MMP11，主要作用于纤维粘连蛋白、层粘连蛋白、弹力纤维、胶原及MMP1、MMP8、MMP9； （4）膜型金属蛋白酶：MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP，主要作用于明胶、型胶原、MMP2。体内绝大多数细胞并不储备MMPs，当需要MMPs的信号传递到细胞后才临时合成，合成的MMPs以无活性的酶原（proenzyme）形式分泌到细胞外，随后被多种蛋白酶和非蛋白酶水解以及热处理激活，一种激活的MMPs可激活另一种MMPs，形成瀑布效应。明胶酶谱法（gelatin-zymography）电泳分析技术具有简便，无需抗体，同步观察多种酶以及活化与否的优势 产品内容产品内容 胶体液（Reagent A） 毫升 凝结液（Reagent B） 毫升 促进液（Reagent C） 微升 胶顶液（Reagent D） 毫升 电泳液（Reagent E） 毫升 上样液（Reagent F） 毫升 复性液（Reagent G） 毫升 消化液（Reagent H） 毫升 染色液（Reagent I） 毫升 祛色液（Reagent J） 毫升 终止液（Reagent K） 毫升 产品说明书 1 份 1保存方式保存方式 保存凝结液 （Reagent B） 在20冰箱里， 其余的保存在 4冰箱里； 胶体液 （Reagent A） 、 促进液 （Reagent C） 、 胶顶液 （Reagent D） 、 上样液 （Reagent F） 、染色液（Reagent I） ，避免光照，有效保证 6 月 用户自备用户自备 无离子水：用于稀释浓缩型试剂溶液 1.5 毫升离心管：用于样品处理的容器 15 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器 50 毫升锥形离心管：用于胶体溶液配制的容器 培养箱：用于孵育反应物 电泳仪：用于蛋白样品电泳分离 平式摇荡仪：用于孵育和混匀反应 实验步骤实验步骤 实验开始前，移取 50 毫升电泳液（电泳液（Reagent E）到 500 毫升容器里，加入 450 毫升用户自备的无离子水，混匀后，标记为电泳工作液电泳工作液。同时将胶体液（胶体液（Reagent A） 、凝结液（） 、凝结液（Reagent B） 、 促进液（） 、 促进液（Reagent C）和胶顶液（胶顶液（Reagent D）放进 25恒温水槽预热。然后进行下列操作。 1 移出 xx 毫升胶体液（胶体液（Reagent A）到 50 毫升锥形离心管里 2 加入 xx 微升凝结液（凝结液（Reagent B） 3 加入 xx 微升促进液（促进液（Reagent C） 4 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡 5 在室温下孵育 45 分钟，或直至胶体凝结 6 移出 xx 毫升胶顶液（胶顶液（Reagent D）到 15 毫升锥形离心管里 7 加入 xx 微升凝结液（凝结液（Reagent B） 8 加入 xx 微升促进液（促进液（Reagent C） 9 混匀后，即刻移入玻璃槽，避免气泡 10插入 0.75 毫米厚的 10 孔梳 11在室温下孵育 45 分钟，或直至胶体凝结 12将玻璃槽移入到电泳槽里 13加入适量的含有电泳液（电泳液（Reagent E）的电泳工作液电泳工作液 14小心拔去 10 孔梳 15用吸管或 1 毫升枪头冲洗样品孔备用 16从70冰箱里取出待测样品（注意：样品须澄清；参见注意事项3） 17移取 10 微升样品（20 微克总量）到 1.5 毫升离心管 18加入 xx 微升上样液（上样液（Reagent F） ，混匀 19室温下静置 10 分钟 20小心移取 20 微升样品到玻璃槽的样品孔里（包括用户自备的蛋白标准样） 21电泳运行 1 至 2 小时，电压为 125 伏，直至染料前沿到达胶底处 21219722关闭电源，取出玻璃板，小心拆开，避免损坏胶体 23放进塑料盒 24加入 90 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里 25加入 xx 毫升复性液（复性液（Reagent G） 26室温下，平放在平式摇荡仪上孵育 1 小时，速度为 50RPM 27小心倒掉复性液 28加入 90 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里 29加入 xx 毫升消化液（消化液（Reagent H） 30放进 37培养箱里，在平式摇荡仪上孵育 20 小时，速度为 50RPM（注意：如果酶活性过低，可以延长孵育时间至40小时） 31小心倒掉消化液 32加入 50 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里 33加入 xx 毫升 染色液（染色液（Reagent I） ，） ，混匀 34室温下，平放在平式摇荡仪上孵育 60 分钟，速度为 50RPM 35小心倒掉染色液 36加入 50 毫升用户自备的无离子水到塑料盒里 37加入 xx 毫升祛色液（祛色液（Reagent J） ，） ，混匀 38室温下，平放在平式摇荡仪上孵育 2 分钟至 30 分钟，速度为 50RPM，直至可见深蓝色背景下白色清晰的条带（注意：避免过度去色） 39小心倒掉祛色液 40加入 xx 毫升 终止液（终止液（Reagent K） 41进行拍照记录或成像仪处理和半定量分析： 基质金属蛋白酶基质金属蛋白酶 阳性条带位置阳性条带位置 说明说明 MMP-2 72 Kd 无活性的酶（proenzyme/latent）MMP-2 62 Kd（或 67 Kd） 活化的酶（active） MMP-9 92 Kd 无活性的酶原（proenzyme/latent）MMP-9 82 Kd（或 84 Kd） 活化的酶（active） 注意事项注意事项 1 本产品为 5 次（45 个样品）操作 2 操作时，须戴手套 3 样品准备要点如下： a) 必须澄清，至关重要：4高速离心 5 分钟，速度为 10000g，置于70保存待测 b) 样品中避免使用 EDTA、EGTA 等二价阳离子鳌和剂以及巯基乙醇和 DTT 等 c) 样品中避免使用硫醇抑制剂（THIOL INHIBITOR） d) 由于 TIMP 等天然抑制剂的存在，血清样品中的基质金属蛋白酶活性很低，可以使用活化剂（建议使用 胶原酶潜酶活化剂（APMA） e) 如果验证样品中基质金属蛋白酶，可以使用抑制剂 EDTA 对照 4 胶体和胶顶配制前，须 25预热相关试剂 5 电泳前注意清洗样品孔 6 电泳运行，注意安全 7 染色时，避免光照 38 染色后显示的亮带 PROMMP9（92Kd） 、浅带 MMP9（82Kd） 、亮带 PROMMP2（72Kd） 、亮带MMP2（62Kd）的条带：在深蓝色背景下的白色条带 9 有时会出现多条带（multiple bands），表明酶的降解产物 10本公司提供系列基质金属蛋白酶酶谱检测试剂产品 质量标准质量标准 1 本产品经鉴定性能稳定 2 本产品经鉴定条带清晰 4