大肠杆菌的 CaCl2化学感受态细胞制备和转化准备工作： 1、LB 琼脂平板若干。 2、50mL 离心管若干，加满超纯水后于 12120 分钟灭菌备用。 3、含有 50mL LB 液体培养基的 250mL 三角瓶若干，12120 分钟灭菌烘干。 4、1.5mL 离心管若干，12120 分钟灭菌烘干。 5、22灭菌甘油溶液：22mL 甘油加入 78mL 超纯水，12120 分钟灭菌，保 存于 4。试剂： 1、100mL1mol/LCaCl2溶液：14.7gCaCl2.2H2O 用超纯水配制成 100mL 贮存液， 灭菌备用，保存于 4冰箱。 2、100mL0.1mol/LCaCl2溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加 90mL 灭菌超纯水混匀， 保存于 4冰箱。 3、100mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液：10mL1mol/LCaCl2溶液加 90mL22的灭菌 甘油溶液，混匀，保存于 4冰箱。感受态细胞制备： 1、晚上从70冰箱活化大肠杆菌（如 DH5 或 JM109） ，划 LB 平板，37 培养过夜。 2、晚上从培养平板上挑取单菌落接种到一支 3mLLB 液体培养基试管，37培 养过夜。 3、早上按 1：100 比例将过夜培养菌液接种到含有 50mLLB 液体培养基的 250mL 三角瓶中，200rpm，37培养 1-2hr 左右，测 OD600到 0.2-0.3 时，转到 50mL 离心管，冰浴 10 分钟左右。 4、以 4000rpm，在 4冷冻离心收集菌体。 5、去上清，用 0.1mol/L10mLCaCl2溶液重悬菌体，水浴 20 分钟左右。 6、以 4000rpm，在 4冷冻离心收集菌体。 7、去上清，将收集的菌体用 1mL0.1mol/LCaCl2甘油溶液重悬，分装成 100l 每个离心管，与70保存。 8、必要时以浓度已知的标准质粒转化制备的感受态细胞以估计效率。转化： 1、从70冰箱取出含有感受态细胞的离心管，在超净台上冰浴，待其融化后， 加入连接产物或对照质粒，冰浴 30 分钟。 2、将离心管从冰浴取出并迅速转到 42水浴热激 90s，然后转冰浴 2 分钟。 3、向每个离心管加入 400-500l 的 LB 培养基，于 37，200rpm 摇 45 分钟以 上，涂相应的抗性或选择性平板，37培养过夜，第二天观察。