柱后光化学反应荧光检测高效液相色谱法测定 茶叶中的五种菊酯类农药残留温裕云1弓振斌31, 2姚剑敏11(厦门大学海洋学系,厦门361005) 2(厦门大学海洋环境科学教育部重点实验室,厦门361005)摘 要 建立了柱后光化学反应荧光检测高效液相色谱法测定茶叶中菊酯类农药残留的方法。采用Hyper2silODS色谱柱,以乙腈/水为流动相、 梯度洗脱进行分离。用自制的光化学反应器作为荧光衍生装置,优化了柱后光化学反应的实验条件,并用于茶叶样品中菊酯类农药残留的测定。方法的检出限为0. 0120. 048g/g(干重) ;线性范围0. 0408. 0g/g,相对标准偏差3. 4%6. 4% (0. 1 mg/L,n=8)。关键词 柱后光化学反应,荧光检测,高效液相色谱,菊酯类农药残留,茶叶2004203209收稿; 2004211215接受 本文系福建省自然科学基金重点项目(No. B0220001)1 引 言茶叶是我国重要出口农产品,为了提高我国茶叶产品在国际上的竞争力,应依据不同国家和地区对茶 叶农药残留限量标准1的规定,尽快建立和完善茶叶制品中农药残留检测技术和安全卫生保证体系。 拟除虫菊酯类农药残留量测定方法主要有气相色谱法(GC)和高效液相色谱法(HPLC)。GC测定 菊酯类农药残留具有分离效果好、 快速、 灵敏度高的优点2, 3 ,但拟除虫菊酯具有热不稳定性,用GC测 定时需要较高的气化温度,且对实际样品的净化过程要求严格;近年来用HPLC法测定拟除虫菊酯的报 道逐渐增多46 ,但紫外 2 可见检测器灵敏度低、 选择性差,难以满足实际样品分析的需要;高效液相色 谱 2 质谱(HPLC2MS) ,设备昂贵,操作复杂,一般实验室无法实现。 光化学荧光法(PCF)是建立在光化学反应基础上的荧光分析技术7 。它以光子为衍生试剂,实验装置简单、 灵活,方法灵敏度和选择性较紫外 2 可见检测器有较大的改善。近年来PCF和流动注射分析 (FI A)810 、HPLC5, 1114 等技术相结合,应用于药物分析9, 10 、 环境污染物分析11、 农药残留分析5, 8, 14 等领域,已逐渐显示其独特的优点。本实验在前期工作15, 16 的基础上,系统研究了光化学衍生 的各种主要影响因素,优化了光化学衍生的实验条件,以光化学衍生荧光检测技术实现了茶叶中菊酯类 农药残留的高灵敏检测,建立了简便、 可靠、 灵敏的菊酯类农药残留检测方法。2 实验部分2. 1 仪器与试剂HP1100高效液相色谱仪(美国Hewlett2Packard公司)。系统配置: HP G1312A二元泵; HP G1315A 二极管阵列检测器(DAD) ; HP G1321A荧光检测器(FLD) ; Rheodyne 7725i进样器; 20L定量环; HPChemStation色谱工作站; HypersilODS色谱柱(5m, 250 mm4. 0 mm i . d. , Germany)。光化学反应器(自制)如图1所示。反应器包括紫外衍生光源(15 W低压汞灯,螺旋形) ,流路(PTFE反应管,美国Zeus Industrial Products公司) ,光化学反应的温度控制模块(恒温箱,实验室自制) ,接口(PEEK头) ,光 反射壁(铝箔)。正庚烷、 乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)。实验用水为超纯水。甲氰菊酯、 氯氰菊酯(96. 8% )标准品购于德国Sigma公司;氰戊菊酯(99. 9% )标准品购于RdH公司;联苯菊酯和氟胺氰菊酯购于农业部环境保护科研监测所。上述农药标准品均用正庚烷配制成一定浓度的标准混合物。2. 2 实验方法 色谱分离条件是在前期工作15 的基础上进一步优化确定的。进行色谱分离条件优化时检测器仍然用DAD,待分离条件确定后用自制的光化学荧光衍生装置在DAD检测器后进行光化学衍生反应,然第33卷2005年3月分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告Chinese Journal ofAnalytical Chemistry第3期301304图1 实验系统示意图Fig . 1 Schematic diagram of the experimental后用FLD进行检测,从而进行光化学反应条 件的优化。实际样品的测定按文献15 的预 处理方法进行,最后以本工作优化后的实验条件进行测定。3 结果与讨论3. 1 流动相及其配比、 流速 以前的实验采用乙腈/水为流动相15 ,在乙腈 水= 7426且流速为1. 2 mL /min时, 5 种菊酯类农药能完全分开,但联苯菊酯的保留 时间较长且谱峰较宽。因此,本实验采用了梯 度洗脱程序,以缩短联苯菊酯的保留时间并改 善其峰形。实验结果表明,以下的梯度洗脱程序能使各组分得到良好的分离且分析时间较 短: 08. 7 min,MeCNH2O = 7426; 8. 711. 0 min,MeCNH2O从7426变为8515; 1120 min,MeCNH2O =8515。流速均为1. 0 mL /min。采用梯度洗脱后荧光检测器基线比二极管阵列检测器基 线稳定,并在15 min内能分析完毕。 流动相组成会影响柱后光化学反应速度、 产物以及产物的荧光发射强度。在实验条件下,选定的流图2 5种菊酯类农药色谱图(组分的浓度均为1. 0mg/L, 20L进样)Fig . 2 Chromatogram of five pyrethriod pesticides (1. 0mg/L, 20L injection)1.甲氰菊酯(fenpropathrin) ; 2.氯氰菊酯1(cyper methrin 1) ;3.氯氰菊酯2 ( cypermethrin 2) ; 4.氰戊菊酯( fenvalerate) ;5.氟胺氰菊酯( tau2fluvalinate) ; 6.联苯菊酯( bifenthrin)。OFF:衍生光源关( the ultraviolet (UV)2lamp is OFF) ; ON:衍生光源开( the ultraviolet (UV)2lamp isON)。动相配比可以得到满意的荧光信号强度。3. 2 荧光检测器激发、 发射波长的选择5种菊酯类农药除联苯菊酯外,其它各组分在没 有经过紫外光照射时均没有荧光发射;而经紫外光 照后,各组分均有较强的荧光(如图2所示)。甲氰 菊酯、 氯氰菊酯、 氰戊菊酯、 氟胺氰菊酯光化学反应产物的激发光谱曲线均有两个峰值,波长分别为279 和221 nm;但各组分在279 nm时荧光信号的基线较 高且不稳定,因而适宜选择221 nm为激发波长。联 苯菊酯光化学反应产物的激发光谱曲线也有两个峰 值,波长分别为258和206 nm,综合考虑其它组分在这两个激发波长下均不能得到最强的荧光信号,且 联苯菊酯的产物在221 nm波长下其荧光信号仍然 较强,因此选择em为221 nm。 甲氰菊酯、 氯氰菊酯、 氰戊菊酯、 氟胺氰菊酯光化 学反应产物的最大发射波长为320 nm,联苯菊酯为340 nm。为了使甲氰菊酯、 氯氰菊酯、 氰戊菊酯、 氟胺 氰菊酯有最大的荧光信号,选择em为320 nm。3. 3 PTFE管内径的选择 实验中采用了3种不同内径(分别为0. 46、0. 38和0. 30 mm)的PTFE管进行实验。对PTFE管内 径的选择要考虑以下因素: (1)应该与色谱分离系统采用的连接管线内径尽量一致,以减少色谱分离效率的损失; (2) PTFE管较小的内径容易使紫外光充分照射管内的流体; (3)流动相流速相同时,较小的PTFE管内径使流动相的线速度加快,减少了紫外光照射的时间。实验结果表明,采用内径为0. 30 mm 的PTFE管,色谱分离效率的损失最小,同时使紫外光的照射较充分,获得较强的荧光信号。3. 4 光化学反应的时间及PTFE管长度的选择 在PTFE管长度一定时,光化学反应的时间随着流动相流速的加快而缩短,荧光信号也随着流速的203 分 析 化 学第33卷加快而变小。图3为PTFE管长度为15m时流动相流速对荧光信号强度的影响。综合考虑荧光信号强 度、 谱峰变宽和色谱分离效率,确定1. 0 mL /min为流动相的最佳流速。此外,还进行了在一定流速(110 mL /min)下,实验了不同长度(分别为6 m、10 m和15 m)的PTFE管对荧光信号的影响,结果表明:在管长为15 m时的荧光信号最大。3. 5 光化学反应温度 光化学反应的温度对光化学反应的速率与效率有重要的影响。实验采用能精确控制温度的恒温箱来 调节光化学反应的温度,研究了不同反应温度对荧光信号强度的影响(如图4)。图中的结果表明,甲氰菊 酯、 氯氰菊酯、 氰戊菊酯、 氟胺氰菊酯在温度为68 时荧光信号(峰面积)最大,联苯菊酯的荧光信号(峰面积)随着温度的升高而增大,综合考虑各组分的荧光信号强度,本实验采用的光化学反应的温度为68。图3 5种菊酯类农药不同流速下荧光信号强度图Fig . 3 Fluorescence intensityvs.flow rate1.联苯菊酯(bifenthrin) ; 2.甲氰菊酯(fenpropathrin) ;3.氯氰菊酯( cypermethrin) ; 4.氰戊菊酯( fenvale2rate) ; 5.氟胺氰菊酯( tau2fluvalinate)。图4 5种菊酯类农药不同温度时荧光信号强度图Fig . 4 Fluorescence intensityvs. photoreactiontemperature曲线15同图3 (curvers 15 are the same as in Fig . 3)。3. 6 方法的检出限、 线性范围和精密度实验采用峰面积的方法对待测目标 物进行定量。表1列出了方法的检出 限、 线性范围以及相对标准偏差。检出 限定义为信噪比(S /N)为3时所对应的 方法检出限17,其中噪音测量的时间为20 min。表1中的检出限已经换算为固 体茶叶样品中最终能检出的目标物的含 量(g/g) ,即样品制备中称取的茶叶样 品为1. 000 g,经提取、 净化、 浓缩后的测 定溶液体积为0120 mL。表中列出的线性范围是工作中实际验证的目标物含量 范围。在此浓度范围内,待测组分浓度 与其相应的色谱峰面积呈线性关系,对 超出该范围的较低或较高浓度,并未进 一步验证。相对标准偏差是0. 1 mg/L标准溶液平行进样8次实验所得。3. 7 实际样品测定 实际样品测定时按文献15 的方法 对样品进行预处理,按优化后的实验条件表1 方法的检出限、 线性范围及相对标准偏差 Table 1 Detection limits, linear ranges, and relative standard deviations for the developed method组 分 Components检出限(g/g)Detection limit线性范围 Linear range (g/g)相对标准偏差 RSD (n=8, % )甲氰菊酯Fenpropathrin0. 0200. 0406. 43. 4 氯氰菊酯Cyper methrn0. 0400. 0808. 06. 0 氰戊菊酯Fenva lerate0. 0400. 0808. 06. 4 氟胺氰菊酯Tau2fluvalinate0. 0480. 0968. 05. 0 联苯菊酯Bifenthrin0. 0120. 0244. 03. 4表2 实际茶叶样品中菊酯类农药残留量(g/g)Table 2 Analytical results of pesticide residues in real world tea samples (g/g)组 分 Components样品1 Sa