欧洲制药学与生物制药学杂志研究论文/2011(79) ：621626 PEG 修饰的麦冬多糖在正常和心肌缺血小鼠体内组织分布的比较林晓1,2，王卓君2，王硕1，沈岚2，冯怡1*，阮克锋1，徐德生31. 上海中医药大学中药现代制剂技术教育部工程研究中心中国上海2. 上海中医药大学中药学院中国上海3. 上海中医药大学上海曙光医院中国上海*通讯作者【摘要 】麦冬多糖经PEG修饰后能延长其在血浆中的停留时间，从而提高其抗心肌缺血的作用，这是一种很有前景的方法。为了全面评价该法的有效性和安全性，本文考察了PEG修饰的麦冬多糖的组织分布。通过麦冬多糖被活化的羟基与mPEG （聚乙二醇单甲醚）末端氨基偶合的适宜反应，可制备具有长循环和生物活性的修饰物，该修饰物每mol 麦冬多糖连接1.04mol 的 20-kDa 的 mPEG 。文中比较了麦冬多糖及其修饰物在正常小鼠和心肌缺血小鼠体内的组织分布。结果表明，修饰物（1.04P20k-R）在正常小鼠体内的组织分布，以AUC排列的递减顺序为肾、肺、心、肝和脑，而在心肌缺血小鼠体内的组织分布，以AUC排列的递减顺序则为肾肺心、肝和脑。除心脏外，心肌缺血未使修饰物（1.04P20k-R）在其他组织分布中发生明显变化。由于修饰物（1.04P20k-R）提高了缺血心肌的渗透性和停留时间，其缺血心脏的AUC 约为正常心脏的1.6倍多。与大鼠体内的麦冬多糖比较，小鼠体内的修饰物（1.04P-20k-R ）组织分布趋势为肾、脑和肺中浓度分别降低约42、1.6 和 1.3 倍，而其在肝中浓度增加约1.3 倍。该研究结果对修饰物的药物开发具有极大的指导意义。【关键字 】 麦冬多糖， PEG修饰，组织分布，心肌缺血1.前言PEG 聚合物与一种药物的共价结合（称为PEG 修饰）是一种很有前景的方法，它可以明显地改善药物的药动学以及药效学的特征。经PEG 修饰后，会延长药物在体内的停留时间，优化了药物在组织的分布，减少了药物的不良反应，降低了药物的降解。这些优点通常能提高病人对药物的顺应性。虽然有文献报道，将PEG 修饰的多糖应用于药物载体或表面活性剂， PEG 修饰的肽类和蛋白质已有约10 种产品上市，但与这些相比，PEG 修饰的碳水化合物的药物相对新颖，也很少报道。麦冬多糖是一种天然的gramian 型果聚糖，其分子量为5kDa，具有抗心肌缺血的活性。然而，经静脉给药后麦冬多糖快速的肾排泄极大地限制了其药效和临床应用。早期研究发现，适宜的修饰物不仅具有生物活性，而且在血液中滞留时间也延长。例如， 发现 PEG （20kDa）结合度约为1 的麦冬多糖的清除半衰期增加了47 倍，而其生物利用度保留了约74%。在另一项研究中发现，心肌缺血大鼠心脏中麦冬多糖（2nm）的聚集浓度约是正常大鼠的2.2倍，这表明，其提高了麦冬多糖在缺血心肌的渗透性和滞留时间（EPR） ，可改善缺血心肌血液中的药物分布。然而， 在很大程度上，麦冬多糖快速的肾排泄限制了提高渗透性和滞留时间（ EPR）的应用，与理想差距很大。修饰物在血液中具有长循环作用，保留了较高的生物活性，比上述提到的胶体给药系统分子更小（10nm） ，该药还能有效提高渗透性和延长滞留时间 （EPR）来被动靶向缺血心肌吗？PEG 修饰和心肌缺血会导致药物在主要的非靶向组织中的分布变化吗？本文研究回答了这些问题，目的是应用这种方法为全面评价修饰物的有效性和安全性提供了有用的信息。2.材料和方法 2.1 材料和动物麦冬多糖（ ROP ，用早期文献方法制备麦冬多糖），聚乙二醇单甲醚- 氨基（ mPEG-NH2，分子量为20kDa，购自 北京键凯科技有限公司，中国-北京 ） ，对硝苯基氯甲酸酯和4-N,N-二甲氨基吡啶（DMAP ） （均购自Fluka 公司，德国 - 布克斯），异硫氰酸荧光素（FITC，购自Sigma，美国 - 密西西里州 - 圣路易斯）、超干二甲亚砜（DMSO, 购自 Acros Organics公司，比利时 - 加尔），二氯甲烷和吡啶（使用前分别用CaH2、KOH进行干燥、蒸馏，购自国药集团化学试剂有限公司，中国-上海），其余购得试剂均为分析纯。昆明小鼠由上海中医药大学动物中心提供，约 4-5 周龄。 实验前， 小鼠在规定环境的饲欧洲制药学与生物制药学杂志研究论文/2011(79) ：621626 养房用标准实验饲料和水自由采食，饲养 4 天。 上海中医药大学实验动物伦理委员会按照（中国）国家实验动物使用法案批准了进行动物实验的所有程序。2.2 异硫氰酸荧光素标记的修饰物的制备麦冬多糖的羟基被活化，与 mPEG 末端的氨基偶合生成修饰物。麦冬多糖的活化率为13% ，与 20kDa 的 mPEG-NH3以 5:1 的摩尔比进行反应，合成的修饰物接枝率达到1.0 。用高速凝胶渗透色谱法（ HPGPC ）结合蒽醌 - 硫酸比色法表征合成物。HPLC系统由 Waters 液相色谱仪和Waters 2414 折光检测器（美国，米尔福德 ）组成。按照早期的方法，合成物经表征后用异硫氰酸荧光素（FITC）进行标记。2.3 分析条件和样品预处理步骤实验仪器为Agilent 1200型 HPLC, 荧光检测器， 检测器激发波长495nm ， 发射波长 515nm。采用高速凝胶渗透色谱法（HPGPC ）以 8.0 300mm Shodex OHpak SB-803 HQ 色谱柱分离样品。用 0.1M 的磷酸缓冲盐液(pH7.4) 洗脱，流速0.5ml/min ，在 30条件下进行色谱分析。每 100l 组织匀浆加40l 高氯酸（浓度为1M ）。混合样涡旋后，以10000r/min转速离心 1min 沉淀变性蛋白。心脏样品在离心前放置2h。取上清液，加30l NaOH （浓度为1M ）进行中和。然后再以10000r/min的转速离心1min，取上清液，按上述方法进行测定。2.4 标准样品和质控样品的制备取异硫氰酸荧光素（FITC）标记的合成物，用磷酸缓冲盐液(pH7.4) 配成 10mg/ml 的储备液。再稀释储备液，配成一系列浓度的标准溶液10-1000 g/ml 。将每份标准溶液置于1.5ml 离心管中，氮气吹干，再加100l 空白组织匀浆，配成定标样品。 该溶液涡旋振荡完全均匀后，按照上述方法预处理混合样。合成物在组织中的最终浓度为 2486g/ml 。在方法有效性中的质控样品（QC ）按定标样品同法处理。2.5 组织分布研究给小鼠每天腹腔注射异丙肾上腺素20mg/kg，连续注射三天诱导小鼠急性心肌缺血。正常小鼠尾静脉注射1 次剂量异硫氰酸荧光素标记的修饰物170mg/kg，然后在给药后规定时间点 0.5h 、1h、 4h 、 12h、 24 h 处死小鼠。迅速取出心、肾、肝、脑和肺，将这些组织浸入生理盐水中，清除血渍，用滤纸吸干，称湿重。用3 倍体积的0.1M 磷酸缓冲盐液(pH7.4)将组织匀化后，-20 保存，备用。2.6 数据分析用均值标准偏差（即S）表示， t- 检验统计分析数据，p0.05 ，表明具有显著的统计学意义。3.结果和讨论3.1 修饰物和异硫氰酸荧光素标记的修饰物的表征（尚未补全）计算得合成物的表观分子平均质量为23.8kDa 。 由于麦冬多糖和mPEG 标定的表观分子平均质量分别为2.06、 21.0kDa，所以合成物的接枝率为每mol 麦冬多糖连接1.04mol 的 20kDa的 mPEG。 为方便起见， 文中以下以1.04P-20k-R 表示该合成物。 由于麦冬多糖和PEG 无直接、微量的分析检测方法，所以用异硫氰酸荧光素预先标记的修饰物（1.04P-20k-R）研究其小鼠组织分布。 用异硫氰酸荧光素标记修饰物后发现，其洗脱位置和峰型无明显差异，这表明反应生成的分子链较稳定。虽然在生理pH 条件下异硫氰酸荧光素标记会产生负电荷，但鉴于合成物中含异硫氰酸荧光素低于0.3%（每 mol 修饰物含0.17mol 的异硫氰酸荧光素）和PEG部分较强的疏水作用，异硫氰酸荧光素标记的修饰物药物动力学和药物分布与未标记的修饰物相似。 实际发现， 早期研究的异硫氰酸荧光素标记的修饰物药物动力学与未标记的修饰物相似。3.2 方法的有效性在本研究中，采用异硫氰酸荧光素进行标记，以高速凝胶渗透色谱法（HPGPC ）测定修饰物（1.04P20k-R）在小鼠各组织中的浓度。该方法在专属性、线性、精密度、准确度、灵敏欧洲制药学与生物制药学杂志研究论文/2011(79) ：621626 度、回收率和稳定性方面有效性好。所得结果（以下）证明该方法具有准确性、专属性和稳定性。对加入标准溶液的小鼠生物样品与静脉给药后采集的异硫氰酸荧光素标记修饰物（1.04P20k-R）的色谱图进行比较，来评价该方法的专属性。结果表明该方法对修饰物（1.04P20k-R）的浓度测定具有专属性（图1） 。异硫氰酸荧光素标记的麦冬多糖和修饰物（1.04P20k-R）的特征保留时间分别为15.1、19.4min。高速凝胶色谱法依据流体力学体积分离待测物，所以待测物分子量的变化会使高速凝胶渗透色谱法（HPGPC）的峰型和位置发生变化。这使高速凝胶渗透色谱法（HPGPC）适合于检测给药后大分子物质的降解。本研究中未见修饰物（1.04P20k-R）发生明显的破坏。图 1 1.表示异硫氰酸荧光素标记的修饰物高速凝胶渗透色谱法（HPGPC）色谱图A 、 B、C、D、 E、F 分别为血浆、肾、肺、心、肝、脑1：空白血浆或组织，2：空白血浆或组织中加入异硫氰酸荧光素标记的标准修饰物，3：空白血浆或组织自静脉注射修饰物后取出4：空白尿5：尿样自静脉注射修饰物后12h 取出6：空白血浆加入异硫氰酸荧光素标记的麦冬多糖（图例中不同的颜色解释，读者可参照本文网络版。）以峰高（ Y）对浓度（ C）做标准曲线，1/C 或 1/CC 加权线性最小二乘法回归。各种组织药物浓度的线性范围良好，相关系数均大于0.998（表1） 。该方法的检测限（DL）与定量限（ QL）分别为1-2g/ml，3-7g/ml，其 DL 信噪比为1： 3，QL 信噪比为1：10（表1） 。表 1 高速凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定小鼠组织中异硫氰酸荧光素标记的修饰物的线性和灵敏性（n=6）组织标准曲线相关系数线性范围检测限（ DL）定量限（ QL）肾Y=0.024C-0.019 0.9995 3.0-162.0 1.16 3.87 肺Y=0.021C-0.001 0.9990 6.0-486.0 2.07 7.14 心Y=0.029C-0.021 0.9995 3.0-243.0 1.06 3.53 肝Y=0.016C-0.027 0.9996 5.0-405.0 1.92 6.40 脑Y=0.024C-0.010 0.9989 2.0-162.0 1.30 4.44 将异硫氰酸荧光素标记的已知含量修饰物加入空白小鼠组织中，测定方法的精密度和准确性。结果表明，日内和日间精密度低于11.1%，准确度范围为93.3%114.3%（表 1） 。用3 个质控浓度测定异硫氰酸荧光素标记的修饰物绝对回收率，比较预处理组织样品的计算浓欧洲制药学与生物制药学杂志研究论文/2011(79) ：621626 度和直接注射同浓度标准溶液的浓度，这些介于57.9%78.1%（表 2） 。保存、冷冻及解冻的分析用生物样品与新鲜制备的生物样品测定结果基本一致，相对误差在15%。表 2 高速凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定小鼠组织中异硫氰酸荧光素标记的修饰物的回收率、精密度和准确性（n=5）组织加入浓度（g/ml）回收率（ %）准确性（ %）精密度 RSD（%）日间日内肾5 73.74.0 107.55.9 5.39 7.36 50 67.02.6 94.93.7 3.92 4.69 100 62.53.0 95.84.6 4.76 4.87 肺10 68.73.3 104.23.6 3.46