324 丝素蛋白及丝素纤维3241蚕丝及丝素蛋白概述丝，通常是指由昆虫或蜘蛛所产生的纤维，也称“天然丝”。自然界中大约有30000 种蜘蛛及 113000 种昆虫纲鳞翅目，大部分物种以及昆虫纲的其他几个物种可以吐丝。但时至今日，人们仅仅研究了少数几种蜘蛛、蚕类(包括桑蚕和柞蚕)和某些螨幼虫所吐出的丝类纤维和丝素蛋白，其中研究最多的是桑蚕丝(bombyx moil silk) 和金丝蜘蛛络新妇 (nephila clavipes) 的拖牵丝 (dragline) 和捕获丝 (capture thread)。然而，直到现在人们还没有成功地开发蜘蛛丝，主要因为蜘蛛同类相食的本能致使人们不能对其进行高密度饲养。桑蚕是人类最早驯化的饲养的昆虫，蚕丝也是人类利用最早、目前产量最大的天然纤维之一，其蛋白质是迄今为止利用最早、研究最广泛的天然纤维蛋白。中国是蚕丝的故乡，发现并使用蚕丝已近有5000 年的历史。蚕丝是一种具有优良特性的天然蛋白质纤维，它因具有独特的光泽、悬垂性、手感等而成为一种“高雅”的纺织纤维，素有“纤维皇后”的美誉。蚕丝中的丝素蛋白是一种天然蛋白质，且具有良好的生物相容性，在生物医学领域，除已用于外科手术缝线、食品添加剂和化妆品外，由于它独特的力学性能，使得蚕丝在临床上有着广泛的应用。(1)蚕丝及丝素蛋白的化学组成。蚕丝蛋白是由丝素蛋白(silk fibroin) 和丝胶蛋白(sericin) 两部分组成，疏水性的丝胶包覆在丝素蛋白的外部，约占重量的25，而亲水性的丝素蛋白是蚕丝中的主要组成部分，约占重量的70，蚕丝中还有5左右的杂质。在丝素蛋白中含有18 种氨基酸，以甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸为主。丝素中含有的氨基酸种类具体可参见表33。表 33 丝素蛋白氨基酸组成每 lOOg 蛋白质中的氨基酸克数(g) 名称柞蚕丝素桑蚕丝素甘氨酸 (sly) 25 85 428 丙氨酸 (ala) 44 1l 324 缬氨酸 (val) 152 303 每 lOOg 蛋白质中的氨基酸克数(g) 名称柞蚕丝素桑蚕丝素亮氨酸 (1eu) 0 40 068 异亮氨酸 (ne) 0 38 087 丝氨酸 (mr) 1289 14 7 苏氨酸 (thr) 047 151 蛋氨酸 (met) O50 O10 半胱氨酸 (eys) 0 23 003 酪氨酸 (晴) 9Ol 118 苯丙氨酸 (phe) 0 47 115 脯氨酸 (pro) 0 47 O63 色氨酸 (trp) 175 O36 赖氨酸 (1ys) O2l O45 精氨酸 (arg) 513 O90 天门冬氨酸 (asp) 8 22 173 谷氨酸 (glu) 212 1 74 组氨酸 (his) 156 032 由于蚕丝种类不同，柞蚕丝和桑蚕丝的丝素蛋白中氨基酸含量具有明显的差别，所用的仪器和测定方法不同，不同季节、不同产地蚕丝蛋白的氨基酸也会稍有差异。从表 3 3中可以看出，柞蚕丝素蛋白组成中，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸的含量占氨基酸总量的 82以上，桑蚕丝素蛋白中以上三种氨基酸含量占氨基酸总量的85以上。除了碳、氢和氮元素外，丝素蛋白还含有多种其他元素，如钾、钙、硅、锶、磷、铁、铜等，这些元素与丝素蛋白的性能及蚕吐丝的机理等有直接关系。(2)丝素蛋白的相对分子质量。丝素蛋白属于纤维蛋白质，由于其分子结构和分子问作用力极其复杂，人们采用不同的方法对丝素蛋白分子的相对分子质量进行了多次测定，但是结果相差较大，而且早期对丝素蛋白分子链是由单一分子链组成还是由多个亚单元组成的复合体的问题也存在分歧。随着基因技术和测试技术的发展，近年比较统一的结论是，丝素蛋白由三个亚单元组成的复合蛋白质：包括重链(H 链 )蛋白亚单元， H 链主要由甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸等组成，是由5263 个氨基酸残基所组成的长链状分子，平均分子量为35105；轻链 (L 链 )亚单元，由262 个氨基酸残基所组成，平均分子量为25104；重链和轻链之间通过二硫键相连的蛋白，平均分子量为25 X 104 ，与 L 链大小相近，但氨基酸组成则完全不同，并且不与H 链共价结合，只是通过其他非共价键结合方式作为丝素蛋白的微量成分存在。(3)丝素蛋白的结构。丝素蛋白主要由甘氨酸，丙氨酸和丝氨酸等氨基酸组成。组成重链的12 个结构域形成了蚕丝纤维的结晶区。但是由于这些结晶区被无重复单元的主序列打散，所以纤维中只有少数有序的结构域。纤维中的结晶结构域由甘氨酸一 x 氨基酸的重复单元组成，x 代表丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在蚕丝纤维中，一个结晶结构域平均由381 个氨基酸残基组成。每个结构域又包含多个六缩氨酸组成的次结构域。这些六缩氨酸包括GAGAGS ，GAGAGY ，GAGAGA 或 GAGYGA(G是甘氨酸， A 是丙氨酸， S是丝氨酸， Y 是酪氨酸 )这些次级结构域以四缩氨酸结尾，比如 GAAS 或 GAGS。丝素重链里较少结晶形成的区域，也被称为连接区，长度在4244 个氨基酸残基之间所有的连接区都有一个完全相同的25 个氨基酸残基 (非重复序列)，这些氨基酸残基由结晶区所没有的带电荷的氨基酸组成。主序列是形成具有天然共嵌段共聚物类似结构的疏水蛋白的主要原因。丝素蛋白结晶形态主要包括I 型丝素和型丝素：I 型丝素分子链是按d 一螺旋和卢一平行折叠构象交替堆积而成；II 型丝素呈反平行卢一折叠层状结构。在温度和溶剂影响下， I 型丝素易向型丝素转变。存在于蚕丝素溶液一空气界面上的一种新的丝素结晶形态，称之为型丝素，其肽链的立体构象为JB 一折叠螺旋。I 型丝素的结构是水溶态，通过加热或者物理纺织可以轻易转变成型丝素结构。当I 型丝素暴露在甲醇或氯化钾溶液中的时候，在体外液态环境里可以观察到I 型丝素的结构转变为卢一折叠结构。l|B 一折叠结构是由一侧为甘氨酸的氢和另一侧为丙氨酸的疏水性的甲基形成的非对称结构，口一折叠排列导致氢和甲基相互作用在晶区形成内折叠；强有力的氢键和范德华力产生的结构是热力学稳定的。氨基酸的分子内和分子间氢键垂直于分子链和纤维。型丝素不溶于水，同时还不溶于多种溶剂，包括弱酸和碱性溶液以及一些离子液体。3242丝素蛋白在生物材料方面的应用丝素蛋白是很早就为人类所重视的天然生物高分子，但自古以来，它的主要应用是在纺织业上。丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，从蚕丝中提取的丝素蛋白具有独特的分子结构，优异的力学性能、良好的吸湿和保湿性能以及抗微生物性能，同时可以方便地做成粒状、纤维状及膜状等形态，具有良好的生物相容性、无毒、无污染、可生物降解，为丝素蛋白在生物材料方面的开发利用提供了依据。(1)丝素蛋白作为固定化酶载体的应用。在研究液状蚕丝素蛋白纤维化机理的过程中，人们发现，丝素蛋白的二次结构将会随着一定的物理或化学作用，如拉伸、剪切、加热、甲醇浸泡等，发生不可逆转的转化，即水溶性的丝素蛋白可通过物理或化学过程变成非水溶性的，这就为酶在丝素蛋白中的固定提供了可能。此类酶的固定化类似于凝胶包埋法，但其具有明显的优点：丝素蛋白变性的程度可以控制，因而减少了酶的渗漏和挤出，提高了固定酶的效率。另外，在固定化的过程中，只涉及极少的化学试剂并且不产生自由基，能较好地避免在普通凝胶包埋中所存在的化学试剂和自由基对酶产生的失活作用，大大增加了活性酶的利用效率。酶的固定化是指通过物理或化学方法将酶固定在某种载体上，使其成为仍具有催化活性的酶或酶的衍生物的过程，从而大大提高酶的使用效率。制备丝素固定化酶主要有包埋法和交联法。采用包埋法将葡萄糖氧化酶固定于丝素膜上，并以甲醇和戊二醛处理的丝素膜作为对照，结果表明：80的甲醇处理的丝素膜比用戊二醛处理的丝素膜有更强的酶活性，且酶的活性可保持98以上，酶的热稳定性和pH 值稳定性都比自由状时增加。丝素膜的红外图谱显示，固定葡萄糖氧化酶(GOD) 后，丝素膜的结构发生变化，甲醇处理前的丝素膜结构含有80的无规卷曲和20反向平行的口一折叠结构，这两种结构分别在丝素膜内部和外表面，根据核磁共振、傅立叶红外光谱等测得丝素膜为不均匀的结构，此结构可防止酶的溶出，这种结构使得丝素膜可保持酶活性一个月以上，在40时，酶性质稳定，而且由于葡萄糖在丝素膜内具有更高的扩散性，使酶也具有更高的活性恢复率。还有用丝素固定过氧化物(POD)和脂肪酶、果胶酶、青霉素酰化酶等制成酶固定化膜，这些酶固定化膜除具备各种高水平酶活性外，其保存时间较长，在酶不失活的情况下可保存两年以上，使酶膜难保存的缺点得以克服。由于采用丝素作为酶固定化材料，获得了更高的灵敏度和响应速度，这些对酶电极是十分重要的。(2)丝素蛋白在药物释放上的应用。药物缓释技术是当前药剂学研究的热点之一，其目的在于寻求提供理想血液药物浓度的途径，提高药物的安全性和有效性。目前采用的控释基材大多用合成高分子材料，但其有许多弊端，而以丝素蛋白高分子材料作基材的控释体系具有明显的性能优势和应用优势，它们包括：丝素蛋白具有良好的力学性能和理化性质，如良好的柔韧性和抗拉伸强度、透气透湿性、缓释性等。天然生物材料作为主要原料应用于医药行业的程序上有更多的便利条件。原料丰富、成本低廉。丝素蛋白为可生物降解材料，不造成环境污染。独特的氨基酸组成，可以通过某些氨基酸的氨基或侧链的化学修饰改变蛋白的表面性能。丝素蛋白在可控条件下可以顺利实现水溶性与非水溶性的双向转化，这是丝素材料独有的优越性能。丝素蛋白材料能够便利地为人体吸收，对人体无任何毒副作用。基于丝素蛋白作为缓释材料主要有以下几个缓释系统：微球微囊药物缓释系统。目前，基于丝素蛋白作为缓释微球微囊的材料主要集中于利用丝素蛋白与其他天然高分子材料复合制成缓释微球微囊。比较常用的有丝素蛋白一壳聚糖微球微囊，丝素蛋白一海藻酸盐微球微囊等。复凝聚法是制备复合微球微囊最常用的方法。复凝聚法制备的微囊药物包封率明显好于单凝聚法。同时复凝聚法包药微囊的缓释效果也优于单凝聚法。原因是复凝聚法制备的微囊是双层膜微囊，