水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 1/6沉积物中有机氯农药类化合物分析规范注：本方法适用于沉注：本方法适用于沉积积物和土壤中有机物和土壤中有机氯农药氯农药的的测测定定1.目目标标化合物化合物20 世纪 70 年代中期，美国在“清洁水法”中规定了 129 种优先污染物，其中有 17 种有机氯农药，本测定的主要有机氯农药是这 17 种，分别是：-六六六（-HCH）、-六六六（-HCH）、-六六六（-HCH）、-六六六（-HCH）、4,4-滴滴滴（p,p-DDD）、4,4-滴滴伊（p,p-DDE）、4,4-滴滴涕（p,p-DDT）、艾氏剂（Aldrin）、狄氏剂(Dieldrin)、异狄氏剂(Endrin)、硫丹(Endosulfan)、硫丹(Endosulfan)、硫丹硫酸酯(Endosulfan sulfate)、异狄氏剂醛(Endrin aldehyde)、七氯(Heptachlor)、七氯环氧(Heptachlor epoxide)、甲氧滴滴涕(Methoxychlor)。其中除了异狄氏剂醛是异狄氏剂的降解产物外，其余 16 种均在环境激素黑名单中。除此之外还有 -氯丹、-氯丹、异狄氏剂酮也作为考察对象。2.试剂、器皿和仪器试剂、器皿和仪器2.1. 试剂试剂二氯甲烷(Dichloromethane)，农残级（美国 Fisher Scientific 公司）；甲醇（Methanol），HPLC 级（美国 Fisher Scientific 公司）；正己烷（n-Hexane），农残级（美国 Fisher Scientific 公司）；硅胶（60200 目），超纯（美国 ACROS ORGANICS）；中性氧化铝（50200 目）， （美国 ACROS ORGANICS）；无水硫酸钠，优级纯，经 450焙烧 12 h后置于密封广口瓶中保存备用；铜片；有机氯农药标准物质：20 种化合物组成的混合标样，购自美国 Supelco Co.；内标化合物（I.S.）：五氯硝基苯（PCNB），购自美国 Supelco Co；回收率指示物(S.S.)：水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 2/62，4，5，6-四氯间二甲苯（TMX）和十氯联苯（PCB209）购自美国 Supelco Co；(Supelco Co.的材料由北京康林公司购买，业务电话：13911205919，010-64926155)。剪刀、滤纸、镊子及药匙（硅胶柱净化所用）：以二氯甲烷超声清洗 15min 两次、正己烷超声清洗 15min 一次；首先硅胶和氧化铝先使用二氯甲烷抽提 72 小时，然后硅胶在 1802、氧化铝在2502分别活化 12 h（activate）；待冷却至室温时，称重后装入大口锥形瓶（250 或500mL），加入其重量 3的蒸馏水去活性（deactivate），添加过程中应用滴管逐滴加入，边加边用力振摇以防止结块，并超声振荡 30 min；放置过夜，平衡后加入正己烷浸没其表面备用（一般也需放置过夜）；石英砂经 450焙烧 4 h，放入干燥器中放置备用。2.2.仪仪器器超声波清洗仪(KQ250D 型数控超声波清洗器)恒温水浴锅（中国科工卫仪器仪表公司）电子天平(精确到 0.0001g，Sartorius AG.Co.,BS1005)冷冻干燥仪(FD-1 冷冻干燥机，北京博医康公司）旋转旋蒸仪(Buchi, Vac 500/rotavapor R-200/Heating bath B-490,Germany)氮吹仪(数控氮吹仪，KL512/5093,康林,北京)蛇形索氏提取器(北京玻璃仪器公司，250 ml)气相色谱仪：HP6890-63Ni 微池电子捕获检测器 (GC-ECD)(Agilent Technologies，美国)，使用 Agilent ChemStation for GC Systems 分析处理数据；毛细色谱柱：HP-5 石英毛细管色谱柱：30 m 0.32 mm ID 0.25 m 液膜厚水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 3/6不锈钢泥抓斗100 级超净工作室；高纯氮气便携式保温箱不锈钢采样小盒玛瑙研钵及研杵2.3 玻璃玻璃仪仪器及其它用品器及其它用品专用玻仪：鸡心瓶、K.D 浓缩器、8ml 定量样品瓶，250ml 分液漏斗，层析柱（长35cm，内径 1 cm，带活塞）、GC 自动进样的样品瓶。常规玻仪及其他用品：100ml、50ml、10ml 量筒；200ml、100ml、50ml 烧杯；500ml、50ml 试剂瓶；胶头滴管、玻璃漏斗、玻璃棒；100ml、50ml 三角瓶（带塞）；坩埚、药匙、5 ml 移液管、微量进样器、乳胶手套、布手套等。所用玻璃仪器均以 10的稀硝酸浸泡过夜，再以重铬酸钾洗液润洗浸泡 20min 以上，分别用自来水、蒸馏水冲洗干净，在烘箱中 110烘干；GC 自动进样的样品瓶、标准样品瓶、层析柱必须用铬酸洗液浸泡一段时间后再认真冲洗干净烘干，并在 400C 高温烘烤 2 小时以上。3.样样品采集与保存品采集与保存使用不锈钢泥抓斗抓取底泥，使用不锈钢小勺将足够量底泥放入溶剂淋洗过的不锈钢容器，并注明采样时间、采样地点、样品编号、样品名称、采样人姓名等。立即冷冻，放入便携式保温箱中带回实验室。样品运回实验室后保存于冰箱（4）中，密封水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 4/6保存(注意避光)，在存放样品时，应尽量注意存放在没有有机气体干扰的区域，以免交叉污染。所采样品在 7 天内前处理完毕，一个月内分析完毕。4. 样品制备4.1.制备冷冻的沉积物样品在室温下融化后，用干净的不锈钢小勺搅拌均匀，然后在冷冻干燥仪上冷冻干燥，干燥后的样品经研磨(研磨后过 60 目不锈钢筛)，准确称取 25.00 g 沉积物样品，加入回收率指示物 TMX 和 PCB209(加入浓度根据当地污染程度确定，原则是与样品中目标污染物浓度相接近)，在平衡 24 小时后，用滤纸包裹(包裹要严实，避免泄漏)。4.2.提取将包有样品的生物样品放入蛇形索氏提取器中，添加 200ml 二氯甲烷，在平底烧瓶中加入 10 片左右底铜片(1cm2)，放在水浴锅中，水浴锅温度控制在 57-590C，回流速度控制在 5-6 次/h，连续抽提 72hrs。在提取结束后，将蛇形管中的溶剂尽量完整的导入平底烧瓶中，作好编号。5. 样品净化5.1.浓缩与溶剂替代将提取液在旋转蒸发仪上(旋转过程中注意蒸发速度，温度 390C,真空度 500)，浓缩至约 2 ml，使用 10ml 正己烷定量转移到 50 ml 鸡心瓶中，再次浓缩至 1ml，完成溶剂替换。5.2.净化 采用硅胶/氧化铝复合柱净化。采用湿法装柱法(图 1)，在干净的 50cm 长内径为10mm 的层析柱上用记号笔在 12cm 和 18cm 处做上记号，层析柱底端塞玻璃棉，水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 5/6取一个干净漏斗置于层析管顶端。先用 10mL 正己烷淋洗层析管，从下端排出至液面刚好浸没石英砂层，此淋洗液废弃。关上开关后，再加入 20mL 正己烷，用湿法装柱，用药匙依次将 12cm 硅胶、6cm 氧化铝从顶端漏斗加入（硅胶、氧化铝层的上界面分别在 12cm、18cm 的记号线位置）。注意在装柱过程中，要不断地加入正己烷以免其黏附在管壁上，并保持正己烷以适当的流速不断地流出，且保证正己烷液面始终高于柱界面（即柱子不能断裂）；同时不断地用吸耳球轻轻敲打滴定管，使硅胶层或氧化铝层紧密。最后以同样方法再在氧化铝层上装入 1cm 的无水硫酸钠，用于样品脱水。调节正己烷液面，使其正好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关备用（注意此时管壁上不得粘有固体颗粒，否则需用正己烷冲洗干净再调节液面）。整个装柱过程中，正己烷可回收循环使用。将 1mL 待净化浓缩样品用滴管移入净化柱中，浸泡 5 min 以上，保证样品与净化柱充分接触交换。第一级洗脱：以 15mL 正己烷分三次洗涤盛有二氯甲烷样品的 K-D 浓缩器，均用滴管移入净化柱中，然后以 60 滴/min 左右的流速流出，直到液面刚好处于无水硫酸钠层面之上，关闭开关。洗脱液用 K-D 浓缩器收集，此为非极性的烷烃组分。第二级洗脱(芳烃组分)：进一步以 70mL 正己烷/二氯甲烷（7:3，v/v）混合液淋洗净化柱，控制流速为 90 滴/min 左右，即成滴而不连续流。洗脱液用100mL 鸡心瓶收集，此为中等极性至非极性的芳烃组分。有机氯农药和多环芳烃即在此组份内。5.3.待测样制备芳烃组分继续浓缩至 2 ml，加入内标(PCNB)，用柔和的氮气吹蒸定容至 1 ml，作为仪器分析待测样。待测液定容后转移至 GC 自动进样用的样品瓶中，用压盖器密封后存放于冰箱中待测。水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 6/66. 分析测定方法6.1.色谱条件HP-5 石英毛细管柱（30m0.32mm0.25m）；检测器放射源为 63Ni；进样口温度：250；检测器温度：300；载气：高纯氮气；柱头压：20psi；无分流进样 1L。升温程序为：柱温初始 85，保持 2min，以速率 10/min 升至 180，保持 15min，再以速率 20/min 升至 280，保持 5min。6.2.定性与定量目标化合物定性利用有机氯农药混合标样 6 次平行分析的平均保留时间对照各色谱峰保留时间对实际样品中的农药进行定性(标准样品色谱图见图 2)。样品中有机氯农药的含量用内标峰面积法定量。7.7. 质量保证与控制质量保证与控制(QA/QC)(QA/QC)体系体系7.1.质量保证/质量控制目标：7.1.1.7.1.1.7.1.1. QA:QA:QA: QualityQualityQuality Assurance,Assurance,Assurance, 准确性、精密性、可比性准确性、精密性、可比性准确性、精密性、可比性7.1.2.7.1.2.7.1.2. QC:QC:QC: QualityQualityQuality Control,Control,Control, 较较较高的可靠性高的可靠性高的可靠性7.1.3. MDL:MDL:MDL:在在在 99%99%99%以上的置信度，某物以上的置信度，某物以上的置信度，某物质质质可被可可被可可被可检检检出和出和出和报报报告的最低告的最低告的最低浓浓浓度。度。度。应应应至至至少分析少分析少分析 3 3 3 个以上的含个以上的含个以上的含预计预计预计方法限方法限方法限浓浓浓度度度 3-53-53-5 倍的目倍的目倍的目标标标化合物的化合物的化合物的搀搀搀混混混样样样品品品获获获得得得 MDLMDLMDL7.2.质量保证/质量控制体系要求：7.2.1.质量控制样品：空白样品，空白加标样，基质加标样，重复样(每 20 个测试样品同时完成一组质量控制样品的测试)。7.2.2.对于 GC/MSD,GC/ECD, 每个工作日使用 DDT 检测进样口对目标化合物是否存在降解现象，每次 DDT 的降解应小于 15.水生态毒理研究组 环境样品中污染物分析方法规范 ChapterChapter 2 2Page 7/67.2.3.目标化合物回收率：通过空白加标样品的测定，得到目标化合物的回收率，应满足 U.S.EPA 标准方法的要求(见表 1)。7.2.4.仪器检测限(IDL)：测定空白样品(n=6)的