制药有限公司 GMP文件第 1 页 共 5 页文件名称高效液相色谱法试验操作规程文件编号JB-QC TZ-004-D 编 制 人编制日期年月日复制份数审 核 人审核日期年月日颁发部门质量部批 准 人批准日期年月日生效日期分发部门化验室、质保科、质量部编订依据中华人民共和国药典2015 年版四部目的： 建立一个高效液相色谱法试验操作规程，保证此项工作顺利进行。范围： 原料、中间体、成品检验。责任： 检验员、 QA监控员、化验室主任、质保科科长、质量部负责人。内容：高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。1. 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。色谱柱内径一般3.9 4.6mm，填充剂粒径为310m 。超高效液相色谱仪是适应小粒径（约2m ）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。1.1 色谱柱反向色谱柱：以键合非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。常用的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等。常用的填充剂有十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。正相色谱柱： 用硅胶填充剂， 或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。常用的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可作反向色谱。离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多空微球等填充剂；对应异构体的分离通常使用手性填充剂。色谱柱的内径与长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但不宜超过60。制药有限公司 GMP文件第 2 页 共 5 页文件名称高效液相色谱法试验操作规程文件编号JB-QC TZ-004-D残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相 pH值一般应在 28 之间。残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于 2 或大于 8 的流动相。1.2 检测器最常用的检测器为紫外- 可见分光光度计检测器，包括二极管阵列检测器（DAD ）、其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外 - 可见分光光度计检测器、荧光检测器、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与被测物质的量有关，还与其结构有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的物质均有响应；结构相似的物质在蒸发光散射检测器的响应值几乎仅与被测物质的量有关。紫外 - 可见分光检测器、荧光检测器、电化学检测器和示差折光检测器的响应值与被测物质的量在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器的响应值与被测物质的量通常呈指数关系，一般需经对数转换。不同的检测器，对流动相的要求不同。紫外- 可见分光检测器所用流动相应符合紫外- 可见分光光度法 ( 通则 0401) 项下对溶剂的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器不得使用含不挥发性盐的流动相。1.3 流动相反相色谱系统的流动相常用甲醇- 水系统和乙腈- 水系统， 用紫外末端波长检测时，宜选用乙腈 - 水系统。 流动相中应尽可能减少不用缓冲盐，如需用时，应尽可能使用低浓度缓冲盐。用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱时，流动相中有机溶剂一般应不低于5% ，否则易将导致柱效下降、色谱系统不稳定。正相色谱系统的流动相常用两种或两种以上的有机溶剂，如二氯甲烷和正己烷等。品种正文项下规定的条件除填充剂种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径与长度、填充剂粒径、流动相流速、流动相组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等，均可适当改变，以达到系统适用性试验的要求。调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X小于等于 33% 时，允许改变范围为0.7X1.3X; 当 X大于 33%时，允许改变范围为X-10%X+10% 。若需使用小粒径( 约 2m)填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配 ; 如有必要， 色谱条件也应作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种项下规定的色谱条件的测定结果为准。当必须使用特定牌号的色谱柱方能满足分离要求时，可在该品种正文项下注明。2. 系统适用性试验色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、灵敏度、拖尾因子和重复性等五个参数。按各品种正文项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品溶液或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。文件名称高效液相色谱法试验操作规程文件编号JB-QC TZ-004-D制药有限公司 GMP文件第 3 页 共 5 页2.1色谱柱的理论板数(n) 用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量色谱柱效能的指标时，应指明测定物质，一般为待测物质或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分色谱峰或内标物质色谱峰的保留时间tR 和峰宽 (W)或半高峰宽 (Wh/2) ， 按 n=16(tR/W)2或 n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。 tR、W 、 Wh/2可用时间或长度计( 下同 ) ，但应取相同单位。2.2分离度 (R) 用于评价待测物质与被分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统分离效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测物质与某一指标性成分( 内标物质或其他难分离物质) 的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测物质与某一降解产物的分离度，对色谱系统分离效能进行评价与调整。无论是定性鉴别还是定量测定，均要求待测物质色谱峰与内标物质色谱峰或特定的杂质对照色谱峰及其他色谱峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应大于1.5 。分离度的计算公式为: R= 2(tR2-tR1) 或R= 2 (tR2-tR1) W1+W2 1.70 (W1，h/2+W2， h/2) 式中 tR2为相邻两色谱峰中后一峰的保留时间; tR1为相邻两色谱峰中前一峰的保留时间; W1、W2及 W1，h/2、W2，h/2分别为此相邻两色谱峰的峰宽及半高峰宽。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数(n) 和分离度 (R) 均以峰宽 (W)的计算结果为准。2.3灵敏度用于评价色谱系统检测微量物质的能力，通常以信噪比(S/N) 来表示。通过测定一系列不同浓度的供试品或对照品溶液来测定信噪比。定量测定时， 信噪比应不小于10; 定性测定时，信噪比应不小于3。系统适用性试验中可以设臵灵敏度测试溶液来评价色谱系统的检测能力。2.4 拖尾因子 (T) 用于评价色谱峰的对称性。拖尾因子计算公式为: T= W0.05h2d1式中 W0.05h为 5% 峰高处的峰宽; d1为峰顶在5% 峰高处横坐标平行线的投影点至峰前沿与此平行线交点的距离。以峰高作定量参数时，除另有规定外，T 值应在 0.951.05之间。以峰面积作定量参数时，一般的峰拖尾或前伸不会影响峰面积积分，但严重拖尾会影响基线和色谱峰起止的判断和峰面积积分的准确性，此时应在品种正文项下对拖尾因子作出规定。2.5 重复性用于评价色谱系统连续进样时响应值的重复性能。采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5 次，除另有规定外， 其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%; 文件名称高效液相色谱法试验操作规程文件编号JB-QC TZ-004-D采用内标法时，通常配制相当于 80%、100% 和 120% 的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2 次，计算平均校正因子，其相对标准偏差应不大于2.0%。制药有限公司 GMP文件第 4 页 共 5 页3. 测定法3.1 内标法按品种正文项下的规定，精密称( 量) 取对照品和内标物质，分别配成溶液，各精密量取适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量进样，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子: 校正因子 (f)= AS/cSAR/cR式中AS为内标物质的峰面积或峰高; AR为对照品的峰面积或峰高; cS为内标物质的浓度; cR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，进样，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量: 含量(cX)=f AXA S/c S式中AX为供试品的峰面积或峰高; cX为供试品的浓度; A S为内标物质的峰面积或峰高; c S为内标物质的浓度; f 为内标法校正因子。采用内标法，可避免因供试品前处理及进样体积误差对测定结果的影响。3.2外标法按各品种项下的规定，精密称( 量) 取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量， 进样， 记录色谱图， 测量对照品溶液和供试品溶液中待测物质的峰面积( 或峰高 ) ，按下式计算含量 : 含量(cX)=cRAXAR式中各符号意义同上。由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定时，以手动进样器定量环或自动进样器进样为宜。文件名称高效液相色谱法试验操作规程文件编号JB-QC TZ-004-D3.3加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称( 量) 取待测物对照品和参比物质对照品各适量，配制待测物校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按下式计算待测杂质的校正因子。制药有限公司 GMP文件第 5 页 共 5 页校正因子 = cA/AAcB/AB式中cA为待测杂质的浓度; AA为待测杂质的峰面积或峰高; cB为参比物质的浓度; AB为参比物质的峰面积或峰高。也可精密称 ( 量 ) 取主成分对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，进样，记录色谱图，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线率的比计算相对响应因子。校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。需作校正计算的杂质，通常以主成分为参比，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液，作为对照溶液; 进样， 记录色谱图， 调节纵坐标范围 （以噪声水平可接受为限）使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%-25% 。除另有规定外，通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差 (RSD)应小于 10%;含量在 0.5%2% 的杂质， 峰面积的RSD应小于 5%;含量大于2% 的杂质， 峰面积的 RSD应小于 2% 。然后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，除另有规定外，供试品溶液的记录时间，应为主成分色谱峰保留时间的2 倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，计算各杂质含量。3.4 不加相对响应因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，或相对响应校正因子可以忽略，可采用不加校正因