华中科技大学同济医学院硕士学位论文淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PIA真核表达载体p C I - PIA 的构建及免疫作用研究硕士研究生贺超导师廖芳华中科技大学同济医学院病原生物学系中文摘要淋病( g o n o r r h e a ) 是由淋病奈瑟菌( N e i s s e r i ag o n o r r h o e a e ，简称淋病奈瑟菌) 引起的经典性病之一。人类是淋病奈瑟菌唯一的自然宿主，主要通过性接触而传播。感染淋病奈瑟菌之后，患者发生泌尿生殖系统的损害，表现为尿道炎和宫颈炎，以及附睾炎、盆腔炎等并发症，女性患者还可由于并发症造成不育、富外孕等严重后果。淋病常见，在世界范围内广为流行；据近年来世界卫生组织估计，全世界每年约有6 2 0 0 万新病例发生，其中以欧美和非洲一些国家尤甚。发病与病人因素，诸如年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式及免疫力有关，并随地区和季节的不同会有所变化。在美国，淋病发病率在男性中最高，而在妇女中带菌最高。美国通过实施淋病控制计划，已使淋病处于3 0 年来最低水平，远低于非淋菌性尿道炎的发病率。我国解放前淋病流行十分严重，解放初期淋病占第三位。到二十世纪六十年代中期，淋病基本被消灭。八十年代淋病又重新传入我国，据1 6 个城市监测，1 9 8 7 年淋病患者为1 1 ，1 1 5 例，1 9 9 7 年发生淋病2 2 4 ，3 3 1 例，1 9 9 9 年3 4 0 ，9 6 0 例，年增长率超过3 0 ，淋病发病率为2 0 6 3 1 0 万，居性病之首。2 0 0 0 年之后开始下降，淋病患者为2 8 5 6 6 1 人，2 0 0 1 年为2 3 4 ，5 6 1 人，居第二位。淋病奈瑟菌主要侵犯粘膜，尤其对单层柱状上皮和移行上皮细胞有很强的亲和力，淋病奈瑟菌侵入前尿道或子宫颈后，借助菌毛、外膜蛋白粘附到柱状上皮细胞表面进行繁殖，之后被柱状上皮细胞吞饮，进入细胞内大量繁殖，导致细胞损伤裂解。淋病奈瑟菌在逸入粘膜下层，通过内毒素与补体、I g M 等协同作用，诱导中性粒细胞聚集吞噬，引起局部急性炎症，出现充血、水肿、粘膜糜烂和尿痛，形成典型华中科技大学同济医学院硕士学位论文尿道脓性分泌物。当细菌进入尿道腺体和隐窝后，腺管丌口及隐窝被阻塞，潜藏的细菌可引起慢性淋病。近年研究发现，淋病奈瑟菌外膜蛋白在致病过程及宿主免疫反应中起着重要作用，其外膜蛋白至少有3 种，分别称为外膜蛋白I ( PI ) 、外膜蛋白I I ( P I I ) 、和外膜蛋白I I I ( P I I I ) ，其中PI 占外膜蛋白的6 0 以上，在细胞膜上形成孔道，又称孔洞蛋白P o r i n ( P o r ) 。淋病奈瑟菌血清学分型主要有PIA 和PIB ，可使水溶性物质、对细菌代谢有重要作用的物质及某些抗生素通过细胞膜进入细胞内。PI 作为外膜中的主要成分，因其相对保守的基因序列及相对稳定的表达而受到越来越多的重视，已经证实纯化的PI 在真核细胞浆膜脂质双分子层中形成电压依赖式离子选择通道，这与淋病奈瑟菌的致病密切相关。PIA 的粘附功能需要孔洞处于一个丌放状态，从而提供电压依赖受体结合部位和或有效的嵌入宿主上皮细胞表面发挥离子通道的功能。淋病奈瑟菌外膜中大部分的PI 以三聚体形式与P I I I 形成复合物。P I I I 暴露的表面随着PI 表型的变化而变化，因此可以怀疑在PI 介导的粘附过程中是否是P i l l 起了实际作用，v a n P u t t e n 等利用基因敲除( k n o c k o u t ) 方法证实，在无PI I I 的情况下真F 起粘附作用的仍然是PIA 。淋病奈瑟菌的致病机制复杂，粘附是其致病的先决条件。淋病奈瑟菌入机体后首先需粘附于泌尿生殖道上皮细胞表面，然后才能进入机体引起一系列病变。以往只认为菌毛是该菌的粘附结构，但近年研究发现，外膜蛋白在致病菌粘附过程中也是至关重要。鉴于该菌的结构特点及致病特点，本研究选用淋病奈瑟菌PIA 基因作为靶基因，构建淋病奈瑟菌真核表达载体( p C I PIA ) ，观察p C I PIA 的PIA 在小鼠肌细胞浆和膜上的表达，研究其在动物体内中所诱导的免疫反应，观察免疫产物体外抗菌效果。本研究工作分以下二个部分一、淋病奈瑟菌真核表达载体p C I PIA 的构建、鉴定和体内表达1 、淋病奈瑟菌真核表达载体p C I PIA 的构建、鉴定常规酚一氯仿法提取淋病奈瑟菌捷克标准株基因组D N A ，根据淋病奈瑟菌外膜蛋白PIA 基因序列设计一对携带限制性核酸内切酶( c o R1 ，S a l I ) 位点的引物，采用P C R 方法获得PIA 全基因片段，产物经酚：氯仿：异戊醇抽提后以乙醇沉淀纯化；华中科技大学同济医学院硕士学位论文纯化产物和载体质粒p C I n e o 分别经E c o RI ，S a lI 酶切后行凝胶电泳回收目的片段和质粒大片段，经T 4 连接酶连接；连接产物转化到感受态细胞中，经氨苄青霉素抗性、双酶切和测序筛选出阳性克隆，命名为p C I PIA 。2 、淋病奈瑟菌真核表达载体p C I PIA 体内表达6 只B a l b c 小鼠分成3 组，每组2 只，分别注射p C I PIA 、空白质粒p C I n e o和生理盐水，1 0 0 u g 3 5 u l 只，初次免疫后1 0 天同剂量行加强免疫一次。来次免疫4天后处死小鼠，取双侧股四头肌作石蜡切片。采用免疫组化方法检测p C I PIA 在小鼠骨骼肌细胞中的表达。结果发现，p C I PIA 在小鼠骨骼肌细胞膜和细胞浆中均获得P I A 的表达，表明淋病奈瑟菌主要外膜蛋白( P I A ) 真核表达载体p C I - P I A 在动物体内表达成功。二、淋病奈瑟菌真核表达载体p C I - PIA 接种、免疫效果的观察1 、p C I PIA 的接种3 0 只# a l b c 小鼠随机分成3 组，每组1 0 只，分别注射p C I PIA ( 1 0 0 u g 3 5 u l 只) 、空白质粒p C I n e o ( 1 0 0 u g 3 5 u l 只) 和生理盐水( 3 5 u l 只) ，初次免疫后第3 周和第6 周各加强免疫一次。分别于第0 周( 免疫前) 、第3 、6 、8 、1 0 、1 2 、1 6 、1 8周，自小鼠尾静脉取血，l O O u Y 只，收集血清，第2 2 周自眼眶取血收集血清。采用E L I S A 方法动态分析小鼠免疫前后血清特异性I g G 抗体水平的变化，以及体外溶菌试验观察免疫血清杀菌效果。结果显示，血清特异性I g G 抗体随着免疫时间的延长，效价逐渐升高，至第1 0 周达到最高值( 1 ：4 0 0 0 ) ，维持到第1 2 周后丌始逐渐下降，至第1 8 周降低到最低水平。2 、抗PIA 抗体体外杀菌效果的观察取2 张玻片，各滴加免疫血清和生理盐水，其中生理盐水为对照组，分别加入活的淋病奈瑟菌，数分钟后观察有无凝集，3 7 。| C1 5 m i n 孵育后，继续加入新鲜F 常小鼠血清( 含补体) ，再孵育3 0 m i n ，反应体系倒入巧克力固体培养基上进行培养，2 4 4 8 小时后观察结果。与阴性对照比较，菌落数减少2 5 即定为杀菌效力为“+ ”；菌落数减少2 5 5 0 即定为杀菌效力为“+ + ”；菌落数减少5 0 7 5 即定为杀菌效力为“+ + + ”；菌落数减少7 5 1 0 0 即定为杀菌效力为“+ + + + ”；菌落数减少华中科技大学同济医学院硕士学位论文5 0 以上为明显杀菌，即该血清对该淋病奈瑟菌临床株具有显著的杀菌作用。3 、T 淋巴细胞增殖反应1 8 只B a l b c 小鼠随机平均分成3 组，分别注射p C l - PIA ( 1 0 0 u g 3 5 u l 只) 、空白质粒p C l n e o ( 1 0 0 u g 3 5 u l 只) 和生理盐水( 3 5 u l 只) ，每周免疫1 次，连续3周，末次免疫7 天后，处死小鼠，取脾制备T 淋巴细胞悬液，调整细胞浓度为2 X1 0 6 m l ，取1 0 0 u l 细胞悬液于9 6 孔板中，实验孔加入1 0u g 纯化PIA 蛋白，对照孔不加PIA 蛋白，温箱孵育7 2 小时后，加入M T T ，孵育4 小时后加入二甲桠砜，测O D 5 7 0 值，实验孔O D 5 7 0 值与对照孔0 D 5 7 0 值差值代表淋巴细胞增殖能力。实验证实p C I - PIA 免疫组小鼠淋巴细胞在体外受到PIA 蛋白再次刺激后出现的明显的增殖，与空白质粒p C I n e o 对照组相比有显著性差异( P O 0 5 。0S02 5目02掣 01 5咤 “0100 503e81 01 21 61 82 2时闻【曲叠空白质牲斟吲蛆臼安黛粗固耋崔E 淋对曼马：蛆圈1E l i s a 植引小鼠血话I 击F i g lD e t e e t i o no ft o t a lI 薛b yE L I s A华中科技大学同济医学院硕士学位论文2 、血清抗菌实验结果从华中科技大学同济医学院附属同济医院皮肤科收集淋病奈瑟菌临床株3 6 株，分别与实验小鼠阳性免疫血清做血清特异性抗体杀菌试验，实验组小鼠血清使其中2 3 株菌发生凝集，并对其中9 株具有显著杀菌效力，杀菌效力为“+ + + ”以上；而对其它1 4 株菌杀菌效果不显著，仅为“+ ”；对剩余1 3 株凝集现象不明显，杀菌效果为“一”。以上结果提示淋病奈瑟菌各表型之间有较大的差异性，小鼠阳性免疫血清对淋病奈瑟菌各表型仅存在部分交叉免疫保护作用。3 、T 淋巴细胞增殖试验利用S P S S1 2 0 对实验数据进行多重均数比对的F is h e rL S D 检验见表1 ，发现实验组和空白质粒组、生理盐水组比较，T 淋巴细胞增殖能力有非常显著性差异，p O 0 5 。表1 小鼠T 淋巴细胞增殖试验统计学分析结果T a b l e1S t a t i s t i c sa n a l y s i so fTl y m p h o c y t ep r o l i f e r a t i o na s s a yi nm i c e注：与生理盐水组比较6 P O 0 5 ，。P O 0 1 ；与空白质粒组p C I n e o 比较。P 0 0 1华中科技大学同济医学院硕士学位论文讨论在自然界，淋病奈瑟菌的唯一自然宿主是人类。淋病奈瑟菌在漫长的进化过程中己经形成了一套逃避人体免疫系统的机制：淋病奈瑟菌根据环境条件可以自主地丌启或关闭膜表面蛋白抗原基因的表达，产生细菌的相变；通过细菌株问的基因重组、细菌基因突变和机体免疫系统筛选等机制( 如淋病奈瑟菌细胞表面的菌毛、O p a和L P S 的抗原变异) 产生具有不同抗原表型的淋病奈瑟菌；淋病奈瑟菌在人群流行传播过程中就具有发生表面抗原微变异的能力 4 1 。这些机制几乎是所有淋病奈瑟菌表面抗原的共同特点，给我们用疫苗预防淋病造成极大地障碍。从目前的淋病奈瑟菌疫苗的研究现状分析，用单一抗原的淋病奈瑟菌疫苗完全预防淋病奈瑟菌感染可能是较困难的【5 然而可以通过这种疫苗接种来缩短淋病奈瑟菌感染的病程，减少传播机会，防止并发症的发生。但是，如果这种接种只是使淋病奈瑟菌感染转为无症状型，感染淋病奈瑟菌的病人因而不就医，那反而会增加淋病奈瑟菌的传播。因此，筛选更有效的保守抗原，研制相应D N A 疫苗并进一步开展多价疫苗的研究显得非常迫切。本研究为筛选有效保守抗原，设计构建真核表达载体p C I PIA ( D N A 疫苗) ，以确定淋病奈瑟菌主要外膜蛋白PIA 作为疫苗成分的价值。通过肌肉注射p C IPIA直接免疫B a l b c 小鼠，E L I S A 检测表明初次免疫3 周