中山大学硕士学位论文中文摘要B c a t e n i n 在类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖机制中作用研究【背景】专业：内科学硕士研究生：肖楚吟导师：潘云峰副主任医师中文摘要类风湿关节炎( r h e u m a t o i da r t h r i t i s ，R A ) 是一种以关节滑膜为主要靶组织的慢性系统性炎症性自身免疫性疾病。关节滑膜衬里层增生，滑膜下层炎症浸润为其典型病理改变。其中类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞( f i b r o b l a s t 1 i k es y n o v i o c y t e ，F L S ) 是介导R A 关节破坏的主要细胞。R A F L S 在慢性炎症过程中被激活后，出现细胞表型的显著改变，具有不完全转化细胞的特性，即使脱离炎症环境，仍持续活化，增殖能力升高，逃脱接触抑制，具有侵袭的能力。R A F L S 体外培养数代后仍能持续自发产生大量细胞因子，这种自分泌、旁分泌的行为可能参与R A F L S 发生肿瘤样改变的机制。本课题设想R A F L S 的这种特性可能与同时具有调控转录和细胞间粘附功能的1 3 c a t e n i n 相关。W n t F z信号转导包含4 条通路，其中W n t 1 3 c a t e n i n 通路在细胞活化、粘附、增殖中具有重要的作用，可以自分泌或旁分泌的方式起作用。B c a t e m n 是该通路中的一个核心成员。在通路未激活状态下，其在胞浆内不断通过磷酸化、泛素化降解而保持低水平。当该通路激活后，1 3 c a t e n i n 不被降解而在胞浆中积聚，进入胞核，可作为转录激活因子激活T C F L E F 转录活性，启动相应基因的转录，从中山大学硕士学位论文中文摘要而引起细胞活化、细胞增殖等。1 3 c a t e n i n 还可在细胞粘附连接处形成E c a d h e r i n 1 3 c a t e n i n - Q c a t e n i n 复合体，介导细胞间粘附，其转录激活功能的增强与细胞粘附功能的丧失是密切相关的。已有研究发现R A 滑膜、R A F L S中W n t 信号分子表达升高，并介导某些细胞因子在R A F L S 中的表达增加。基于以上R A F L S 和B c a t e n i n 的特性，以及前人的研究结果，提示B c a t e n i n 可能参与了R A F L S 增殖机制。【目的】明确1 3 c a t e n i n 在R A F L S 细胞增殖机制中的作用。【材料和方法】收集行关节腔镜或关节置换术患者关节滑膜标本，R A 组、骨关节炎( o s t e o a r t h r i t s ，O A ) 组( O A 组) 、关节创伤组各6 例。在三组标本中进行H E染色，应用免疫组化方法检测1 3 c a t e n i n 在滑膜衬里层中的表达情况。同时将3组标本采用酶消化法或组织块法进行关节滑膜F L S 的原代细胞培养并鉴定。三组选取行酶消化法分离培养的第三代F L S 各3 例进行后续实验。分别应用R T - P C R 、W e s t e r nb l o t 方法检测三组F L S 中1 3 c a t e n i n 的m R N A 表达和蛋白质表达，应用M T T 法比较三组F L S 的细胞增殖情况。对R A F L S 进行B c a t e n i n的s i R N A 干扰。M T T 法检测应用L i C I 激活W 州B c a t e n i n 通路后关节创伤组F L S 细胞增殖的改变。【结果】在三组滑膜中应用酶消化法和组织块法均培养出F L S ，H E 染色证实所用组织均仅为滑膜组织，镜下观察 9 9 细胞呈成纤维细胞样，流式细胞仪检测C D 5 5的表达均 9 9 。成功应用s i R N A 干扰的方法在R A F L S 中实现1 3 c a t e n i n 的基中山大学硕士学位论文中文摘要因沉默。免疫组化显示1 3 c a t e n i n 在R A 滑膜衬里层中表达的评分较对照组( O A组和关节创伤组) 均明显增高，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。M T T 法检测结果显示，R A F L S 的细胞增殖较O A 组、关节创伤组F L S 增高。1 0 m M 浓度的L i C I 刺激后，关节创伤组F L S 的O D 值较非刺激状态下增高，差异有统计学意义( P 8 0 时，吸弃培养液，用P B S ( 含双抗) 轻轻洗3次，加入胰蛋白酶E D T A 溶液覆盖底面。显微镜下观察至大部分细胞变圆后将培养瓶竖起，加入适量1 0 F B S 培养液( 含双抗) 终止消化，吸管吹打后移至1 5 m l 离心管中，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，加入适量1 0 F B S 培养液( 含双抗) 吹打混匀后，按1 ：3 传代，分装接种到培养瓶中，置于5 C 0 23 7 培养箱中培养。根据细胞的生长情况及培养液的变化，每1 3 天更换培养液1 次。若杂质较多，换液前用P B S ( 含双抗) 轻轻洗1 2 次。2 4 4 1 4 细胞冻存当生长至约覆盖8 0 底面时，更换培养液过夜。吸弃培养液，用P B S ( 含双抗) 轻轻洗3 次，加入胰蛋白酶E D T A 溶液覆盖底面。显微镜下观察至大部分细胞变圆后将培养瓶竖起，加入适量2 0 F B S 培养液( 含双抗) 终止消化，吸管吹打后移至1 5 m l 离心管中。经细胞计数后，1 0 0 0 r p m 离心5 分钟，弃上清，加入适量的冻存液，吹打混匀后按每支l m l 分装到冻存管中。将冻存管放入细胞冻存盒中，置于8 0 低温冰箱过夜后，转移到液氮中保存。2 4 4 1 5 细胞复苏将细胞从液氮中取出，迅速浸没于3 7 水中，摇动数分钟至完全溶解。经细胞计数后将细胞移至培养瓶中，加入适量的2 0 F B S 培养液( 含双抗) ，混匀后置于5 C 0 23 7 “ C 培养箱中培养，2 4 小时后更换培养液。之后根据细胞的中山大学硕士学位论文材料与方法生长情况及培养液的变化，每1 3 天更换培养液1 次。若杂质较多，换液前用P B S ( 含双抗) 轻轻洗l 2 次。2 4 4 1 6 细胞计数将细胞悬液吹打混匀后，用吸管吸5 滴细胞悬液到离心管中，加入5 滴台盼蓝染液，吹打均匀。然后吸取少量悬液沿细胞计数板上盖片边缘缓缓滴入，至盖片下刚好充满悬液。在低倍镜下观察，以未染色细胞为活细胞，计数四个大格子活细胞数。按照下面公式分别计算活细胞、总细胞密度：细胞悬液的细胞数m l = ( 四个大格子细胞数4 ) 2 1 0 4 。并计算活细胞百分比。用于细胞接种。2 4 4 2 流式细胞仪检测F L S 表面标记物当细胞培养至第3 代细胞，经消化重悬制成l 1 0 5 m l 的单细胞悬液，送中山大学附属第一医院行流式细胞仪检测C D 5 5 的表达。2 5R A F L S 中1 3 c a t e n i n 的s i R N A 干扰2 5 1组织标本1 例应用酶消化法分离培养至第3 代的R A F L S 标本。2 5 2 主要试剂1 3 一c a t e m ns i R N A ( h ) ( S e - 2 9 2 0 9 ) ，美国S a n t aC r u z 公司。S i R N AT r a n s f e c t i o nR e a g e n t ( S C 一2 9 5 2 8 ) ，美国S a n t aC r u z 公司。S i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n ( S C - 3 6 8 6 8 ) ，美国S a n t aC r u z 公司。C o n t r o ls i R N A A ( S C - 3 7 0 0 7 ) ，美国S a n t aC r u z 公司。中山大学硕士学位论文材料与方法2 5 3 实验步骤2 5 3 1将所用细胞按2 1 0 5 孔接种至6 孔板，用1 0 F B S 培养液( 不含双抗) 培养。2 5 3 2 当细胞生长至6 0 “ - - 8 0 时，配制：( 以下均严格无酶操作，避光)溶液A1 ：C o n t r o ls i R N A A2 u l + s i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n10 0 u l ；溶液A 2 ：1 3 c a t e n i ns i R N A ( h ) 2 u l + s i R N A T r a n s f e e t i o nM e d i a n1 0 0 u l ；溶液A 2 ：1 3 c a t e n i ns i R N A ( h ) 4 u l + s i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n10 0 u l ；溶液A 2 - D c a t e n i ns i R N A ( h ) 6 u l + s i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n10 0 u l ；溶液A 2 ：1 3 c a t e n i ns i R N A ( h ) 8 u l + s i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n10 0 u l ；溶液B ：s i R N AT r a n s f e c t i o nR e a g e n t + s i R N AT r a n s f e c t i o nM e d i a n1 0 0 u l ；2 5 3 3 将溶液A l “ 5 分别与溶液B 混和，室温孵育约3 0 m i n 。2 5 3 4 吸弃旧培养液，用s i R N A T r a n s f e c t i o nM e d i a n 将细胞洗一遍，吸弃液体，立即进入下一步。2 5 3 5 将s i 砌叮AT r a n s f e c t i o nM e d i a n8 0 0 u 1 分别加入到混和溶液A B I - - - 5中，混匀后加至孔1 “ - 5 中，孔6 加R P M I1 6 4 0l m l ，培养约1 0 h 。2 5 3 6吸弃液体，用1 0 F B S 培养液继续培养7 2 小时。2 5 3 6 按2 6 4R T - P C R 实验步骤操作。2 6R 1 1 - P C R2 6 1 组织标本2 6 1 1 选取应用酶消化法分离培养的第三代F L S ，其中R A 组3 例，O A组3 例，关节创伤组3 例。2 6 1 2 如上2 5 3 6 步骤所处理的F L S 。2 6 2 主要试剂中山大学硕士学位论文材料与方法T r i z o l 试剂，I n v i t r o g e n 公司。F e r m e n t a sR e v e r t A i d 第一链e D N A 合成试剂盒，含D E P C 处理水，O l i g o ( d T ) l s引物( 0 5 u g u 1 ) ，5 反应缓冲液，R i b o L o c kR N A 酶抑制剂( 2 0 u u 1 ) ，d N T P混合物，R e v e r t A i dM M u L V 反转录酶( 2 0 0 u u 1 ) ，F e r m e n t a s 公司。D N AM a r k e r l ，6 载样缓冲液，广州