1凉燥致病机制的实验研究【摘要】 目的研究凉燥对小鼠的主要致病机制。方法 216 只无特定病原体级（SPF）昆明小鼠随机分为常温常湿组（A 组），常温燥组（B 组），凉燥组（C 组），每组 72只。在模拟凉燥条件下造模，第 7 天与第 14 天检测气道与皮肤组织病理、气管纤毛运动、气道液分泌（RS）与气道液 IgG 抗体（IgG R）、血液流变学、细菌攻击实验与气管细胞 bcl-2 基因、bax 基因表达。结果与 A 组相比，C 组第 14 天气管、肺与皮肤病变明显，肺细菌数增高，IgG R 增高，第 7 天 RS 降低（P0.01），血液流变学影响不明显，但气管细胞 bcl-2 基因表达下降。结论 凉燥伤肺、伤津，致气道“纤毛-黏液毯”局部御邪屏障受损；肺津凝滞于肺，以致宣输失司则皮肤失养。本结果为凉燥致病提供实验资料。 【关键词】 凉燥 致病机制Abstract：ObjectiveTo investigate the pathogenic effects of Cool-Dry on mice.Methods216 Kunming mice(SPF) were divided into three groups including group A(normal mice), group B(normal temperature and Outer Dry mice),group C(Cool- Dry mice),72mice/group. Respiratory secretion of Mucopolysacchride(RS),IgG of Respiratory(IgG R)，hemorrheology，Bacterial attacking and Expression of bcl 2，bax gene were tested in day 7 and 14.ResultsIn group C the pathologreal changes of respiratory and skins were obvious, and bacillia quantity of lung increased,bcl 2 gene expression was reduced significantly compared with group A(P0.01) .ConclusionIt has first provided the evidences of Cool Dry that injured the windpipe and skins and the defenced of “lanket of Cilla-mucus”and reduced the expression of bcl-2 gene, which was related to the mechanisms of Cool Dry.Key words：Cool-Dry; Pathogenic mechanism燥气清冷肃降，肃杀收引， “燥气先伤于华盖”，易伤津液。 “秋深初凉，西风肃杀，感之者，多病风燥，此属燥凉，较严冬风寒为轻。 ”外燥有温燥与凉燥之分，但未见凉燥病机系统性实验研究报道。在相关研究中证实外燥致小鼠气道病变的基础上21，本文研究凉燥及相兼细菌攻击对小鼠气管纤毛运动、气道液分泌与气道液IgG 抗体、血液流变学及气管细胞 bcl 2 基因，bax 基因表达等影响，为阐析凉燥致病机制提供资料。1 材料与方法1.1 动物无特定病原体级（SPF）昆明种小鼠 216 只，体重（181）g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2003-2005。1.2 仪器与试剂LRH 250 人工智能气候箱（温度：（30651），相对湿度：（3090）%5%，广东医疗器械厂），XSJ D 恒温倒置显微镜（重庆显微镜厂），CS501 超级恒温器（重庆实验仪器厂），756MC 紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），FASCO 全自动血液流变仪（重庆南方医疗设备公司）。咔唑（批号：054K078，Sigma 公司），D-葡萄糖醛酸内酯（批号：2711EC，Sigma 公司），四硼酸钠与台氏液试剂、10%甲醛、HE 染料（分析纯，批号：050108）上海精细化工科技有限公司。TUNEL 试剂盒（MK1020，2005 03）、bcl 2 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0412，2005 03）、bax 兔抗鼠 IgG 多抗（BA0315，2005 03）和阳性对照片由武汉博士德生物工程有限公司提供。1.3 菌株金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 25923，北京天坛生物制品公司)。31.4 方法1.4.1 动物模型及分组216 只昆明小鼠随机分为常温常湿组、常温燥组、凉燥组，每组 72 只，分批置人工气候箱内、用昆明种小鼠饲料常规饲养。按表 1 模拟外燥“温度 相对湿度 风”条件进行造模。各组第 7 天和第 14 天进行检测前 4 h 禁食、禁水。表 1 各组小鼠“温度相对湿度风”处理条件（略）1.4.2 病理组织学观察断颈处死小鼠，常规取气管 1.5cm，右肺组织（中）（4010）mg/只、背部皮肤（0.5 cm 0.5 cm）及左足垫皮肤，HE 染色、镜检。1.4.3 气管上皮纤毛运动实验（Cilia movement of Tracheal Epithelium,CM,min/mm）：按文献方法2。1.4.4 气道液黏多糖（Respiratory secretion of Mucopolysacchride,RS,g/ml）测定：咔唑比色法，参考文献方法2。1.4.5 气道液 IgG（IgG-R）检测常规气管插管，取灌洗液分离上清，按酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒说明书检测。以包被液作空白对照，PBS pH 7.4（10%小牛血清）作阴性对照。每份样品检测 3 次，记录标本均值与阴性对照（P/N）倍数之平均值。1.4.6 血液流变学检测34受血液流变仪对血量标本的限制，每组取 9 只小鼠眼球血合为 1 份标本进行测试，3 份/组。肝素抗凝管取眼球血，4 h 内测定血浆黏度、红细胞聚集指数、红细胞刚性指数。1.4.7 细菌攻击实验取培养 18 h 金黄色葡萄球菌，经标准比浊法配成细菌悬液（1108 cfu/ml），各组小鼠于第 7 天经鼻常规滴种金黄色葡萄球菌 0.1 ml/只，24 h 后重复 1 次。接种细菌第 6 天无菌取小鼠右肺（4010）mg/只常规检测肺细菌数（Bacillia Quantity,BQ，1106 cfu/g 取均值），以及 RS 与 IgG R 4。 1.4.8 气管细胞凋亡检测第 14 天取气管切片，按脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）试剂盒程序操作。结果判断：气管上皮细胞核内出现棕黄色颗粒为TUNEL 染色阳性。镜下随机计数 200 个细胞，计算：细胞凋亡率(%) = 凋亡细胞数 200 100%1.4.9 气管细胞 bcl-2 基因，bax 基因表达检测 第 14 天常规取气管标本切片、按试剂盒说明书操作。结果判断：气管上皮细胞浆内出现棕黄色颗粒为 bcl-2（或bax）表达阳性。镜下计数 500 个细胞，计算：阳性指数（PI）=阳性细胞数记数细胞数 100%1.4.10 统计学处理5实验数据以s 表示，采用 SPSS13.0 软件，资料之间比较用 ANOVA 分析，显着性检验采用多个样本均数间 q 检验（Newman-Keuls 法）；各组第 7 天与第 14 天比较用 t 检验，P0.05 认为差异有统计学意义，检验水准为双侧 =0.05。2 结果2.1 气管、肺结构观察常温常湿组第 7、第 14 天气管上皮结构完整、纤毛整齐，气管腺体、细支气管与肺泡未见异常，背部皮肤结构完整，毛球数多，新生毛干数丰富且层次清晰，足垫皮肤汗腺丰富。常温燥组第 14 天部分气管纤毛倒伏、黏连，肺泡轻度淤血，皮肤未见异常；凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生，气管纤毛多呈灶状缺损，20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，肺部淤血、水肿明显，均较第 7 天严重；背部皮肤无明显异常，但足垫部皮肤腺体明显减少与皮下结缔组织增生。2.2 凉燥对气管上皮纤毛运动（CM）、气道液黏多糖（RS）与 IgG R 的影响结果见表 2。表 2 凉燥对小鼠气管纤毛运动、气道液黏多糖与 IgG-R 的影响(略)2.3 凉燥对小鼠血液流变学的影响见表 3。与常温常湿组比较，凉燥组血液流变学指标改变无显著性。表 3 凉燥对小鼠血液黏度的影响(略)2.4 凉燥相兼细菌攻击对小鼠肺细菌数（BQ）、呼吸道液黏多糖（RS）与 IgG-R的影响见表 4。表 4 细菌攻击对凉燥小鼠 BQ、RS 与 IgG-R 的影响（略）2.5 凉燥对气管细胞凋亡与 bcl-2 基因、bax 基因表达的影响见表 5。表 5 凉燥对小鼠气管上皮细胞 bcl-2、bax 基因表达与细胞凋亡的影响(略)3 讨论6按表 1 条件处理，病理检查可见凉燥组第 14 天气管上皮鳞状化生与炎性细胞浸润，气管纤毛多呈灶状缺损，肺泡充血、水肿明显，表明凉燥伤肺、伤津，肺失其濡养而致组织细胞结构受损；20%气管浆液腺上皮黏液腺化生，提示与凉燥肺津生成障碍相关；足垫皮肤汗腺明显减少与结缔组织增生等，表明肺宣输失司、皮毛腠理失之濡润，合以卫表不固，致“燥气先伤于华盖”。本结果为凉燥致病提供组织学证据。气道液内含黏蛋白（主为黏多糖和蛋白质），覆盖于黏膜表面形成黏液毯，是气道的重要保护性屏障之一；RS 与气道液分泌呈正相关，其主要作用是湿润气道黏膜、保护上皮的纤毛运动。与常温常湿组比较，凉燥组第 7 天 RS 减少，显示凉燥早期气道液分泌严重减少而具“干”之特点。值得注意的是凉燥组第 14 天 RS 明显增多（P0.01），其机理可能是凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化、凝聚成痰饮，故气道液明显增加。气道纤毛受“凉凝”之气道液刺激而病理性运动加快。凉燥组细菌攻击后 RS 明显减少，也提示生物病原攻击可加重气道分泌障碍与“正气”受损5。IgG-R 是气道重要免疫防御成分之一，凉燥组第 714 天以及细菌攻击后 RS 增高，与机体的保护性反应有关。凉燥相兼细菌攻击，外则卫滞邪郁，内则津少气虚，抗邪无力则病邪入里；肺津不化则凝成痰饮，细菌及其毒素可加重肺津生成障碍与宣输失司更甚，加之气道局部御邪屏障受损则对生物病原攻击的敏感性增高，但故凉燥组肺细菌数是常温常湿组的 7.1 倍，结果提示凉燥病机之一与损伤气道分泌与“纤毛-黏液毯”有关。凉燥组血液黏度变化不明显，但红细胞刚性指数增高，提示血液运行障碍，其机理有待研究。bcl-2 属于低丰度表达基因，编码的 bcl-2/bax 家族蛋白如 bcl-2/bax 二聚体为抑7制细胞凋亡构型，bax/bax 二聚体可诱导细胞凋亡。结果显示，常温常湿组与凉燥组气管细胞凋亡率均较低（0.3%），但凉燥组气管 bcl-2 阳性细胞多见于气管纤毛缺损或鳞状上皮化生处，提示与凉燥致病机制相关。结果表明，凉燥主要病机可能是：凉燥伤津，凉燥之邪的凉气可伤肺阳而致肺津不化，凝集成痰饮，合以宣输失司，皮毛腠理失养而致卫表不固；肺津生成锐减，气道“纤毛-黏液毯”生物防御屏障受损，合以对生物病原攻击敏感性增加等综合因素致病。凉燥致气管细胞 bcl-2 基因表达下调与凉燥致病机制的相关性值得研究。【参考文献】1丁建中，张六通，邱幸凡，等.外燥对小鼠气管上皮纤毛运动与呼吸道液分泌的影响J.中医杂志，2006，48（8）：607.2徐叔云，卞如濂，陈 修.药理学实验方法，第 3 版M.北京：人民卫生出版社，2002：1360.3童一秋.医院体检化验检验技术标准数据解读实用手册M.吉林：吉林音像出版社，2003：382.4许 浒，许燕萍，黄庆华.