1三草安前汤对慢性非细菌性前列腺炎模 型大鼠 IL-1、IL-6 及 TNF R表达的 影响作者：周青,熊伟,张国民,方圆,肖红玉,龚秀英【摘要】 目的 观察三草安前汤对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠炎症因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子受体(TNF R)基因和蛋白表达的影响,阐明中药复方治疗慢性非细菌性前列腺炎的炎症因子蛋白靶点。方法 将 72 只健康雄性 Wistar 大鼠随机分为 6 组,每组 12 只,除正常组外,其余 5 组应用大鼠前列腺蛋白提纯液辅以免疫佐剂制备实验性慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型,正常组、模型组予生理盐水,西药组予消炎痛,三草安前汤大、中、小剂量组分别予不同剂量的三草安前汤连续灌胃。30 d 后处死,采用免疫组织化学、荧光定量 RT-PCR 等方法检测炎症因子 mRNA 及蛋白表达。结果 三草安前汤可显著降低慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠炎症因子 IL-1、IL-6 的 mRNA 及蛋白表达水平(P0.01),且大、中剂量组作用优于小剂量组(P0.05),大、中剂量组与正常组比较差异无统计学意义(P0.05)；三草安前汤各剂量组 TNF R表达降低,未随剂量增加出现明显变化(P0.05)。结论 三草安前汤对慢性非细菌性前列腺炎模型大鼠异常的免疫功能有调节作用,降低炎症因子表达是其治疗慢性前列腺炎的重要机理。 【关键词】 三草安前汤；慢性非细菌性前列腺炎；炎症因子；动物模型Abstract： Objective To observe the effects of Sancaoanqian decoction on expression of cytokine IL-1, IL-6 and TNF R in experimental autoimmune 2prostatitis rats, and explore the target protein of cytokine of Chinese herbal compound in treating chronic nonbacterial prostatitis. Methods Seventy-two male Wistar rats were divided randomly into six groups and 12 rats in each group. All groups were made experimental autoimmune prostatitis rat model by injecting SC purified prostate protein with FCA except normal group. The normal and model group were given saline, western medicine group was given indomethacin, large, medium and small doses decoction groups were treated with large, medium and small doses of Sancaoanqian decoction. All rats were sacrificed after 30 days. The mRNA and protein expression of cytokines were tested by methods of immunohistochemistry and fluorescent quantitation RT-PCR. Results Sancaoanqian decoction could reduce the mRNA and protein expression of IL-1, IL-6 in experimental autoimmune prostatitis rats. There were no significant difference between large and medium doses decoction group, but had a better activity than small dose. The expression of TNF R were reduced in all doses groups and no difference among three doses of Sancaoanqian decoction. Conclusion Sancaoanqian decoction can regulate the immune function in chronic prostatitis rat model. Down-regulation of cytokines maybe one of important mechanisms in treating chronic prostatitis.Key words：Sancaoanqian decoction；chronic autoimmune prostatitis；cytokine；animal model慢性非细菌性前列腺炎(CAP)是男科临床常见的难治性疾病之一,炎症因子在CAP 的发病过程中与炎症的过程、转归相关。前期临床观察显示,三草安前汤治疗湿热挟瘀型 CAP 取得满意的临床疗效1。为进一步探讨其作用机制,笔者从基因、蛋白水平考察了三草安前汤对 CAP 模型大鼠炎症因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子受体(TNF R)基因表达的影响。1 实验材料1.1 动物健康雄性 Wistar 大鼠 77 只,3 月龄,体重 200300 g,湖南中医药大学实验动物中心提供。1.2 主要试剂3免疫组化相关试剂：兔抗大鼠 IL-1 单克隆抗体,兔抗大鼠 IL-6 单克隆抗体(Eptomics 公司,美国)；兔抗大鼠 TNF Receptor Type 单克隆抗体(Prosci 公司,美国)；SABC 免疫组化试剂盒,DAB 显色试剂(武汉博士德)。实时定量荧光 RT-PCR相关酶类及试剂：细胞总 RNA 提取试剂 Trizol(Gibco 公司,美国),焦碳酸二乙酯DEPC(Promega 公司,美国)；Olig(dT)15, dNTP 混合物(上海 Sangon)；M-MuLV、RNA 酶抑制剂(Promega 公司,美国)；SYBR Green 荧光染料(罗氏公司,瑞士)。1.3 主要仪器DU640 核酸及蛋白分析仪(Beckman 公司,美国)；721B 型分光光度计(上海第三仪器厂)；7300 实时荧光定量 PCR 仪 (ABI,美国)；高速低温离心机(Beckman 公司,美国)；TY-80S 脱色摇床(江苏华峰仪器有限公司)；台式离心机(Beckman 公司,美国)。2 实验方法2.1 分组77 只雄性 Wistar 大鼠,其中 5 只用于前列腺蛋白提纯液的制备,其余 72 只随机分 6 组,分别为正常对照组、模型组、西药组及三草安前汤大、中、小剂量组(以下简称“SCAQ 大、中、小剂量组”),每组 12 只。2.2 大鼠前列腺蛋白提纯液的制备参照文献2方法。取实验大鼠 5 只,无菌条件下剥取前列腺组织,生理盐水洗净,加入含 0.5% TritonX-100 的生理盐水溶液,冰浴匀浆,10 000 r/min 离心 30 min。吸4上清,比浊法测定蛋白浓度。临用时用 0.01 mol/L pH 7.4 PBS 调节蛋白浓度至 15 mg/mL。2.3 模型制备参照文献2方法。大鼠乙醚麻醉,腹腔注射百白破疫苗 0.5 mL,多点皮下注射大鼠前列腺蛋白提纯液和 FCA(11 混悬液)1 mL,正常对照组皮下注射生理盐水,30 d重复注射 1 次。第 60 日时每组处死 2 只,取前列腺病理检查,验证造模是否成功。2.4 药物制备及给药三草安前汤由金钱草、益母草、白花蛇舌草、红藤、虎杖、丹参、王不留行等药物组成(湖南中医药大学第一附属医院提供)。药物经高压浓缩煎药机煎煮后过滤浓缩,根据人-大鼠体表面积换算系数确定大、中、小剂量组,分别为 4.45、2.23、0.89 g/mL 原药材量,按 1 mL/100 g 体重剂量灌胃。西药组给药消炎痛(山西云鹏制药有限公司,批号 H14020771),剂量参照说明书,临用时将药捣碎,生理盐水溶解并稀释成 0.9 mg/mL,按 1 mL/100 g 体重剂量灌胃。造模 60 d 后各组开始给药,模型组及正常对照组用生理盐水灌胃。30 d 时处死大鼠。2.5 样本取材末次给药后 24 h 处死大鼠,剥离前列腺并称重,1/3 组织置 DEPC 水中漂洗 3 次,迅速入液氮保存待提取总 RNA,其余 2/3 组织入甲醛固定,石蜡包埋切片,病理切片 HE 染色,免疫组织化学染色。2.6 免疫组化检测炎症因子表达5根据 SABC 试剂盒操作说明书进行。2.7 前列腺组织总 RNA 的提取及 cDNA 的制备根据 Trizol RNA 提取试剂盒说明书操作。2.8 引物采用实时荧光定量 RT-PCR 的方法,IL-1、IL-6、TNF R、18S rRNA PCR 引物根据相关基因的大鼠 cDNA 序列进行设计。引物及探针均由上海生工生物工程公司合成。引物设计采用 Primer 5.0 软件设计。2.9 实时荧光定量 RT-PCR 方法检测前列腺炎炎症因子的基因表达取反转录的 cDNA 2 L 为模板进行 PCR 反应检测炎症因子基因表达。反应体系：2SYBR Green PCR minister 20 L,上、下游引物各 1 L(0.25 mol/L),去离子水 16 L。充分混匀后加入 cDNA 模板 2 L。PCR 反应条件：95 10 min；95 变性 15 s,58 退火 30 s,72 延伸 30 s,40 循环；85 检测荧光。溶解曲线分析,95 1 min,65 1 min,以 0.1 /s 的速度升高温度至 95 ,连续检测荧光。扩增结束后分析溶解曲线,在溶解曲线上具有(850.8) Tm 峰判断为 PCR 扩增的单一性。同时设无模板对照、无 RT 对照及阳性对照。目的基因 mRNA 定量：取一定量的 cDNA 模板,分别 2、5、8、10 倍稀释,依次进行实时 PCR 扩增,建立标准曲线,以 - actin mRNA 的模板量为参照,计算目的基因的相对模板数。 3 统计学方法实验数据用 xs 表示,采用方差分析,组间比较用 q 检验。全部数据经 SPSS10.0统计软件包处理,P0.05 为差异有统计学意义。64 结果4.1 一般情况造模前每组大鼠 12 只,造模及灌胃过程中模型组死亡 1 只,SCAQ 小剂量组死亡1 只,60 d 时为评估造模情况每组处死 2 只,最后剩余正常组 10 只,模型组 9 只,西药对照组 10 只, SCAQ 小剂量组 9 只, SCAQ 中剂量组 10 只,SCAQ 大剂量组 10只。所有动物于给药后 30 d 时处死。4.2 各组大鼠前列腺组织白细胞介素-1、白细胞介素-6 及肿瘤坏死因子受体蛋白表达IL-1 的棕色的阳性反应主要在前列腺腺泡上皮细胞的胞浆或间质,细胞核不染色,部分组织还可见阳性反应的条索状结构；IL-6 在正常前列腺组织中有少量表达,主要表达细胞为腺腔内上皮细胞；TNF R表达主要存在于腺体上皮细胞胞膜上。结果见表 1。表 1 三草安前汤对 CAP 模型大鼠前列腺组织炎症因子蛋白表达水平的影响(略)注：与模型组比较,*P0.05,*P0.01；与正常组比较,P0.05,P0.01(下同)4.3