1Cav1.3 L型钙通道 K228E 突变体的构 建及功能研究作者：强华，孙超峰，魏 峰，张爱峰，史瑞明，马爱群，崔长琮【摘要】 目的 通过构建 Cav1.3 基因 K228E 突变，观察 K228E 突变对 L 型钙通道电生理特性及蛋白表达和转运的影响。确定钙通道 1 亚基结构域S4 段上N 端带正电荷的氨基酸对该通道电生理学特性的作用，从而为创建钙通道起搏器奠定基础。方法 一步法快速定点诱变构建 Cav1.3 基因 K228E 突变体的真核表达载体;膜片钳观察突变钙通道电流，激光共聚焦技术观察突变钙通道蛋白在细胞内的表达和定位。结果 检测表达于 HEK293 细胞上的 L 型钙电流：转染野生型 Cav1.3 质粒和相关亚基质粒，可检出 L 型钙电流，其半激活电压V1/2=(-36.562.08)mV、半失活电压 V1/2 =(-42.930.14)mV(5mmol Ba2+);而转染K228E Cav1.3 质粒和相关亚基质粒的 HEK293T 细胞上未检测到钙电流;检测 K228E 突变通道蛋白在细胞内的表达和定位：转染野生型和突变型 Cav1.3 质粒及相关亚基质粒，48h 后观察到野生型与突变型钙通道蛋白在细胞膜上都有表达。结论 Cav1.3 基因 K228E 突变虽不影响 L 型钙通道蛋白质的表达与转运，但却不表达钙通道电流，是一种功能丧失性突变。 【关键词】 生物起搏;Cav1.3;L 型钙通道;定点诱变;膜片钳ABSTRACT: Objective The study is to construct the K228E mutation of Cav1.3 and evaluate its effect on electrophysiological characteristics and protein expression and transport of L type calcium channel. The effect of amino acid with positive charges in N terminal of segment S4 of Cav1.3 on electrophysiological characteristics of L type calcium channel is also investigated so as to create a calcium channel 2pacemaker. Methods The eukaryotic expression vector for K228E Cav1.3 mutant was constructed by rapid site directed mutagenesis; Ca2+ current was measured by patch clamp technique; the expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein were observed by laser confocal microscopy. Results Patch clamp recordings of Ca2+ current: There was obvious current from HEK293T cells transfected with pCDNA6 WT Cav1.3 and related subunit, V1/2 from steady state activation curve was (-36.562.08)mV; V1/2 from steady state inactivation curve was (-42.930.14)mV (5mmol/L Ba2+). However, there was no current from HEK293T cells transfected with pCDNA6 K228E Cav1.3 and related subunit. The expression and subcellular localization of Ca2+ channel protein: 48 hours after the HEK293T cells were transfected with WT Cav1.3 or K228E Cav1.3 plasmids, both the channel protein of WT Cav1.3 and K228E Cav1.3 were expressed on cell membrane surface. Conclusion The K228E mutation of Cav1.3 channel has no effect on the protein expression and transport of L type calcium channel. It is a functional loss mutation which has no expression of Ca2+ current.KEY WORDS: biological pacemaker; Cav1.3; L type calcium channel; fixed point mutation; patch clamp以病态窦房结综合征为主的缓慢型心律失常在临床上并不少见，永久型人工起搏器植入是目前治疗有明显症状的缓慢型心律失常患者最有效的方法，但由于其存在着不少缺点，如起搏器缺乏对神经体液调节的反应性、电池能量的有限性以及感染、血栓等1，因此，国内外有学者试图寻找生物起搏的方法，以期达到生理性起搏的目的。生物起搏的核心是选择一种合适的离子通道编码基因作为导入基因。由于用野生型基因构建的生物起搏，其起搏频率适应生理变化的灵活性不足2，所以有必要通过分子生物学技术，将野生型离子通道的个别基因进行突变，改变该离子通道的功能，从而构建一个新的起搏基因。Cav1.3 L 型钙通道在窦房结细胞起搏中起着重要的作用3。如果对该通道的编码基因进行重构，改变其电压激活特性，将其去极化激活改为超极化激活，或将其激活阈值下调(-90mV)，有望构建出一个适合起搏的离子通道。本文对钙通道 1 亚基结构域S4 段上N 端带正电荷的氨基酸对该通道电生理特性的作用进行了探索性研究。31 材料与方法1.1 材料 携带全长鼠 Cav1.3 基因(GenBank：AF370009)、Cav3 基因和Cav2 基因的质粒 pcDNA6 Cav1.3、pcDNA3.1 Cav3 和 pcDNA3.1 Cav2由美国 Brown 大学 LIPSCOMBE D 教授惠赠，质粒 pRK5 GFP 由美国 Wisconsin大学 ANSON BD 博士惠赠。大肠杆菌 Top10 由我室保存。HEK293T 细胞株购自中国典藏培养物保存中心。去内毒素超纯质粒中量提取试剂盒购自美国 Omega公司。基因突变试剂盒 QuikChange XL Site Directed Mutagenesis Kit 购自美国 Stratagene 公司。转染试剂 LipofectamineTM 2000 购自美国 Invitrogen 公司。Cav1.3 抗体购自以色列 Alomone Labs。其他试剂均为进口或国产分析纯。1.2 方法1.2.1 Cav1.3 K228E 突变体的构建 我们拟将 Cav1.3L 型钙通道 1 亚基结构域S4 段中第一个带正电荷的碱性氨基酸 赖氨酸(K228)诱变为带负电荷的酸性氨基酸 谷氨酸(E)。根据 QuikChange XL Site Directed Mutagenesis Kit 的要求，我们设计引物如下(将第 682 位碱基 AG)：5 GGAGGCT TTGATGTCGAAGCCCTCCGTGCC 3;3 CCTC CGAAACTACAGCTTCGGGAGGCACGG 5。按照试剂盒的说明进行操作。提取质粒后，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆并将突变结果送北京奥科生物技术有限责任公司测序。1.2.2 转染 HEK293T 细胞 HEK293T 细胞在含 100mL/L 胎牛血清的 DMEM培养基中培养。转染前 1d，细胞铺板在 500L 含血清、不含抗生素的正常生长的DMEM 培养基中(24 孔板)，使其在转染日密度为 50%60%。转染质粒4pcDNA6 WT Cav1.3(或 pcDNA6 K228E Cav1.3)、 pcDNA3.1 Cav3、pcDNA3.1 Cav2 和 pRK5 GFP 质粒基因(荧光标记)的比例为 3331。采用LipofectamineTM 2000 脂质体转染法，每孔细胞用 18.75L 无血清培养基稀释0.3g 质粒和 0.75L LipofectamineTM 2000，按试剂盒操作步骤进行。转染后放入 37、50mL/L CO2 培养箱，培养 48h 后进行实验。1.2.3 基因转染 HEK293T 细胞的通道电流测定 HEK393T 细胞在转染后48h，经胰酶消化成单细胞悬液，4h 内进行全细胞膜片钳实验。膜片钳放大器为Axon 700B 单探头膜片钳放大器(美国 Axon 公司)，数据采集由 Clampex9.2 完成(美国 Axon 公司)。玻璃毛细管(北京正天易科贸有限公司)用 p 97 微电极拉制仪(美国 SUTTER INSTRUMENT 公司)拉制，冲灌电极内液后的电阻阻抗为25M。记录钙通道电流时采用的电极外液成分(mmol/L)：Choline Cl 135，MgCl2 1，BaCl2 5，HEPES 10，用 CsOH 调至 pH 7.4;电极内液成分(mmol/L)：CsCl 135，EDTA 1，EGTA 1，MgATP 4，HEPES 10，用 CsOH 调至 pH 7.4。采样参数设置方案(Protocol)：ICa L 电流 电压(-)曲线测定：在电压钳模式下，钳制电压-100mV，指令电压去极化自-80mV 至+60mV，阶跃是 10mV，每一个指令电压维持时间是 300ms，刺激频率 0.5Hz。加用 P/4 漏减。以各刺激电位下电流峰值相对值与相对应电位作-曲线图。ICa L 激活曲线测定：采用上述同样方法，将指令电压改为去极化自-80mV 至-10mV，记录到 ICa L 激活电流，以电流相对值对条件刺激电压作 ICa L 激活曲线图并按 Boltzmann 方程进行拟合，求得半激活电压。ICa L 稳态失活曲线的测定：设定钳制电压为-80mV，施于 1000ms、阶跃为+10mV、去极化自-80 至+10mV 的系列条件脉冲刺激，在每5一条件脉冲后紧跟一固定除极至 0mV、150ms 的测试脉冲，记录 ICa L，之后电位降至-80mV。以电流相对值对各条件刺激电压作 ICa L 失活曲线图，并经Boltzmann 方程进行拟合，求得半失活电压。1.2.4 细胞免疫荧光检测 Cav1.3 L 型钙通道蛋白的表达 24 孔板中放入预先经明胶处理过的盖玻片，将对数生长期的 HEK293T 细胞铺于板上，继续生长12h。将 pcDNA6 WT Cav1.3(或 pcDNA6 K228E Cav1.3)、pcDNA3.1 Cav3 和 pcDNA3.1 Cav2 按照 111 的比例进行转染，48h 后吸弃培养液，40g/L 多聚甲醛固定 15min，PBS 洗 3 遍后，3mL/L 的 Triton X 100室温下打孔 15min，山羊血清封闭 30min;一抗 Cav1.3 抗体(125)孵育，4过夜;PBS 洗 3 遍;避光 3