1LHR 真核表达载体构建及表达【摘要】 目的 构建黄体生成素受体（LHR）真核表达质粒载体和建立稳定高表达LHR 的乳腺癌细胞株。 方法 Kpn/Hpa双酶切 LHRcDNA 质粒载体获得目的基因，定向克隆构建 pcDNA3.1(+)真核表达载体，酶切图谱和序列分析鉴定；重组质粒载体经脂质体转染 MCF7 乳腺癌细胞，G418 筛选，RTPCR、细胞内cAMP 测定，筛选鉴定高表达 LHR MCF7 细胞。 结果 重组质粒 pcDNA3.1(+)LHR 酶切图谱分析结果、序列分析证明 pcDNA3.1(+)LHR 载体中 LHR 序列与 GenBank 的 LHR 基因序列完全相符。RTPCR 检测 MCF7 细胞 LHR mRNA，MCF7 细胞内 cAMP 浓度测定，证实 MCF7 细胞高表达 LHR。 结论 构建并转染 pcDNA3.1(+)LHR 真核表达载体，在 MCF7 细胞中稳定表达，为探讨 hCG 对乳腺癌细胞的作用提供实验基础。 【关键词】 受体, LH； 绒毛膜促性腺激素； 乳腺肿瘤； 克隆细胞； 遗传载体； 基因表达 RNA, 信使人绒毛膜促性腺激素 (human chorionic gonadotropin，hCG)是胚胎滋养层细胞分泌的一类具有重要生理功能的糖蛋白激素，通过与黄体生成素受体（luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptor，LHR）结合发挥生物作用1。近年的研究发现乳腺细胞存在 hCG 受体，因此有学者认为妊娠期 hCG 对乳腺细胞的直接作用可能与生育后妇女乳腺癌发生率降低相关24。笔者通过建立高表达LHR 的乳腺癌细胞株，探讨 hCG 对乳腺癌细胞的直接作用，以提供实验细胞模型。1 材料与方法21.1 材料 MCF7 乳腺癌细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。含 LHRcDNA 的质粒载体由美国 Louisville 大学 Zhenmin Lei 教授提供。胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；DMEM 培养基、G418、质粒载体pCDNA3.1(+)、pEGFP、脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000、RNA Trizol（美国Invitrogen 公司）；限制性核酸内切酶 Apa（美国 Promega 公司），限制性核酸内切酶 Kpn及 Nhe（美国纽英轮生物技术有限公司）；1Kb DNA ladder Marker、小抽质粒抽提试剂盒（上海申能博彩生物科技有限公司）；大抽质粒抽提试剂盒Hispeed plasmid midi kit(25)（德国 QIAGEN 公司）；RTPCR 试剂（日本 TaKaRa公司）；cAMP EIA kit（美国 Cayman 公司）；hCG（美国 Sigma 公司）。引物合成与测序由上海英骏生物技术有限公司完成。1.2 方法 参照文献56。1.2.1 构建 pcDNA3.1(+)LHR 重组质粒 Kpn/Hpa双酶切 LHRcDNA 质粒载体、Kpn/EcoR V 双酶切 pcDNA3.1(+)载体，琼脂糖电泳分离，胶回收纯化，T4DNA 连接酶将 pcDNA3.1(+)载体与 LHRcDNA 片段连接，构建的重组质粒命名为 pcDNA3.1(+)LHR，具体操作步骤按说明书。按常规方法将重组质粒转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞，在含氨苄青霉素（100 g/mL）LB 平板挑取单克隆，于2 mL LB 培养扩菌，小量快速抽提试剂盒抽提载体质粒。应用酶切图谱分析方法鉴定，选取酶切图谱分析结果鉴定的 2 个克隆载体 DNA 送上海英骏生物技术有限公司进行 DNA 序列测定。pcDNA3.1(+)LHR 质粒载体在含 100 g/mL 氨苄青霉素的液体 LB 中大量培养，用 Hispeed plasmid midi kit 抽提质粒。1.2.2 重组质粒转染 MCF7 细胞 将 MCF7 细胞按每孔 2105 接种于 24 孔细3胞培养板（美国 corning 公司），24 h 后按每孔 0.4 g 及 1 g 分别将 pcDNA3.1(+)LHR 重组质粒及空载体质粒以 LipofectamineTM2000 转染入 MCF7 细胞，具体操作按试剂说明书。1.2.3 筛选转染细胞 转染 24 h 后，加入 400 g/mL G418 筛选转染细胞，每隔 2 d 换液，直至出现细胞克隆。用胰酶消化，在显微镜下挑取克隆，移至 24 孔板继续培养，G418 筛选，并再次挑取单克隆细胞，大量培养。1.2.4 鉴定转染细胞1.2.4.1 RTPCR 鉴定 根据已发表的 LHR 基因序列（NM 013582）设计并合成引物。引物序列：F：5ACAGCTGCTGGTGCTGGCAATG3R：5TCCCTTGGAAAGCGTTCCCTG3RTPCR 两步法扩增 500 bp LHR 目的片段，扩增条件如下：反应经 94 预变性 5 min 后进入循环；94 变性 45 s57.5 退火 45 s72 延伸 75 s，扩增 32个循环；循环结束后 72 延伸 10 min。取 5 L PCR 产物，琼脂糖凝胶电泳，观察有无特异目的条带。1.2.4.2 cAMP 浓度测定方法鉴定 将稳定转染 LHR 的 MCF7 细胞按每孔4105 接种于 12 孔细胞培养板，24 h 后弃旧培养基，用无血清 DMEM 培养基洗2 遍，每孔加入含 0，0.16，1.6，16 IU/mL hCG 的 DMEM 培养基 0.4 mL, 置于体积分数为 0.05 的 CO2、37 培养箱培养 2 h，收集上清液，按操作说明书测定。2 结 果42.1 重组质粒鉴定 重组质粒 pcDNA3.1(+)LHR 酶切图谱分析，琼脂糖电泳结果见图 1。酶切图谱显示，酶切结果与 pcDNA3.1(+)LHR 重组载体酶切位点相符。2.2 测序结果 以质粒 pcDNA3.1(+)的通用引物 BGH、T7 为测序引物，测定结果显示 pcDNA3.1(+)LHR 载体中 LHR 序列与 LHR 基因序列完全符合。2.3 转染细胞的筛选、鉴定 重组质粒转染 MCF7 乳腺癌细胞后，经 G418 筛选，14 d 后 24 孔板上见 G418 抗性的细胞克隆形成。经 2 次筛选后转染重组质粒的细胞挑出 8 个克隆，提取细胞 RNA，经 ND1000 紫外分光光度测定 RNA 浓度，经RTPCR 扩增，发现转染重组质粒后细胞表达 LHR，转染空载体细胞不表达目的 LHR（图 2），选择第 8 克隆细胞进行实验。LHR 属于 G 蛋白偶联受体超家族成员，对 LH 与 hCG 有高亲和性，cAMP 作为第二信使，参与其信号转导。本实验通过检测 hCG 作用后转染 LHR 及空载体 MCF7 细胞内 cAMP 浓度（表 1），证实转染 LHR 的 MCF7 细胞高表达 LHR。 3 讨 论hCG 的主要生理功能是刺激卵巢黄体分泌孕酮，维持妊娠，促进乳腺发育。近年来的研究发现 hCG 具有抑制乳腺癌发生、发展的作用，针对 hCG 的表 1 hCG 对乳腺癌细胞 cAMP 浓度影响研究可望能为乳腺癌的防治提供新的思路79。hCG 在体内的重要生理功能是由 LHR 介导。但由于 LHR 在乳腺细胞表达较低，体外 hCG 对乳腺癌细胞的作用不明显，影响作用机制的深入研究，因此本实验通过建立稳定高表达 LHR 的乳腺癌细胞株，为探讨 hCG 对乳腺癌细胞的作用机制提供体外研究的细胞模型。5笔者成功构建了 pcDNA3.1(+)LHR 真核表达载体，经 LipofectamineTM2000 转染，G418 筛选，获得高表达 LHR 的 MCF7 细胞克隆。LHR 在 hCG 刺激后，激活膜内腺苷酸环化酶，促进 ATP 转化为 cAMP，cAMP 进一步激活 PKA，cAMP是 LHR 信号转导途径重要的信息传递分子5。hCG 作用于稳定表达 LHR 的MCF7 细胞，其 cAMP 水平明显升高，证实转染后 MCF7 细胞表达 LHR，成功构建高表达 LHR 的 MCF7 细胞。这一工作的完成，为进一步研究 hCG 对乳腺癌的作用及其作用机制提供前提条件。【参考文献】1 Stenman U H, Tiitinen A, Alfthan1 H, et al. The classification, functions and clinical use of different isoforms of HCGJ.Hum Reprod Update, 2006,12(6)： 769784.2 Russo J, Moral R, Baloqh G A, et al. The protective role of pregnancy in breast cancerJ. Breast Cancer Research, 2005,7(3)：131142.3 Meduri G, Charnaux N, Loosfelt H, et al. Luteinizing hormone/human chorionic gonadotropin receptors in breast cancerJ. Cancer Res, 1997,57(5)：857864.4 Janssens J,Russo J,Russo I,et al. Human chorionic gonadotropin(hCG) and Prevention of breast cancerJ. Mol Cell Endocrinol, 2007,269(12)：9398.5 Rao Chv,Li X,Manna S K,et al. Human Chorionic Gonadotropin decreases proliferation and invasion of breast cancer MCF7 cells by inhibiting NFappaB and AP1 activation J. J Biol Chem, 2004,279(24)：2550325510.6 萨姆布鲁克 J,弗里奇 E F,曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南M.金车雁，译.2版. 北京：科学出版社, 1992：1659.7 Russo J, Russo I H. The etiopathogenesis of breast cancer preventionJ. Cancer Lett， 1995，90(1):8189.8 Russo I H,Russo J. Primary prevention of breast cancer by hormoneinduced differentiationJ. Recent Results Cancer Res, 2007,174：111130.9 Russo J,Baloqh G A,Chen J,et al. The concept of stem cell in the mammary 6grandand and its implication in morphogenesis, cancer and preventionJ. Front Biosci, 2006,11：151172.