1EA204 对兔离体主动脉的影响作者：李娟 付守廷 李辉 陈国良 王锐 姚遥【摘要】 摘要：目的 研究雌酚酮衍生物 EA204 对兔离体主动脉的作用及其作用机制。方法 兔主动脉环离体实验。结果 EA204(10-5310-3mol/L)可以剂量依赖性地抑制氯化钡、氯化钾、去甲肾上腺素引起的兔离体主动脉环的收缩。兔离体主动脉环经亚甲基蓝或吲哚美辛预处理后，分别可使 10-510-4 或 10-4310-3mol/L EA204 的舒张作用受抑制；经普萘洛尔预处理后，对 EA204(10-5310-3mol/L)的舒张作用无影响。结论 EA204 舒张兔离体主动脉的作用与NO-cGMP 途径及前列腺素合成酶途径有关。 【关键词】 雌酚酮 兔 主动脉 阻断剂雌酚酮衍生物 EA204 于 2005 年由 Cooperwood John S 首次报道合成成功1，合成者对其抗癌活性进行了初步考察，结果表明，该化合物有较弱的抗癌活性。本研究采用本室合成的 EA204 观察其对兔离体主动脉的作用，并对其作用机制进行了初步探讨。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 实验动物 中国白兔，雌雄不限，体重(2.000.26)kg，由宁夏医科大学实验动物中心提供，健康状况符合国家普通实验动物健康标准。1.1.2 实验仪器 HSS-1(B)型恒温浴槽(成都仪器厂)；RM6240B 型多通道生理2信号采集处理系统(成都仪器厂)；JZJ01 型肌肉张力换能器(成都仪器厂)；医用供氧器(河北省冀州市福利医疗器械厂)；电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。1.1.3 药品 雌酚酮衍生物 EA204(沈阳药科大学药物化学教研室提供，经核磁共振氢谱和碳谱测试确定结构)；亚甲基蓝(沈阳市试剂三厂，批号 041024)；吲哚美辛口服乳液(辽宁省人民医院，批号 20060428)；盐酸肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，批号 6A09025)；重酒石酸去甲肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，批号 5A11008)；氯化钡(沈阳市兴东试剂厂产品，批号 20020928)；盐酸普萘洛尔(天津力生制药厂股份有限公司，批号：0611007)。1.2 方法1.2.1 兔离体主动脉环标本的制备2 用 3%的戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉注射将白兔麻醉后，迅速剥取兔胸主动脉条，制成宽 35mm 的环状标本，将标本置于盛有 10mL 营养液的浴管中，一端固定在通气钩上，另一端连接在张力换能器上，通过记录仪记录张力变化。浴管内保持温度(370.5)，并以每秒 12 个气泡的速度通入混合气体(95O2+5CO2)。标本初始负荷 1g，每 20min 换一次营养液，平衡 1h，待基线稳定后开始实验。1.2.2 EA204 累积浓度舒张曲线的制备3 向浴管内加入致痉剂(氯化钡 10-4 mol/L 或氯化钾 610-2 mol/L 或去甲肾上腺素 10-6 mol/L)诱导标本收缩，当达到最大收缩后，充分洗净标本，待标本恢复稳定后，再次用同浓度致痉剂诱导二次收缩，当与前一次收缩基本一致时，分别累积加入 EA204(10-5310-3 mol/L)，建立 EA204 累积浓度舒张曲线。31.2.3 经阻断剂处理后的 EA204 累积浓度舒张曲线的制备3 向浴管中加入去甲肾上腺素 10-6 mol/L 或氯化钾 610-2mol/L)诱导标本收缩，建立 EA204 累积浓度舒张曲线(参照 1.2.2)，作为对照；充分冲洗标本，标本恢复活性后，再次向浴管中加入同浓度去甲肾上腺素或氯化钾，标本达到稳定的收缩后，加入亚甲基蓝(10-5mol/L)或吲哚美辛(10-5mol/L)或普萘洛尔(10-6mol/L)，共浴 15min 后重新建立 EA204 累积浓度舒张曲线。舒张百分数用 EA204 舒张的张力去甲肾上腺素或氯化钾激发张力的比值表示。1.3 统计学方法 各组数据均以均值标准差(s)表示，采用 t 检验比较舒张百分数的差异有无统计学意义。2 结果2.1 EA204 对兔离体主动脉环的舒张作用(表 1)EA204(10-5310-3mol/L)能不同程度地抑制氯化钡、氯化钾、去甲肾上腺素引起的兔离体主动脉环的收缩，其抑制效应呈浓度依赖性。表 1 EA204 对致痉剂收缩的离体兔主动脉环的舒张作用（略）2.2 阻断剂对 EA204 舒张血管效应的影响2.2.1 亚甲基蓝对 EA204 效应的影响(表 2)标本经亚甲基蓝(10-5mol/L)预处理后，EA204(10-510-4mol/L)舒张去甲肾上腺素收缩的兔离体主动脉环的作用受抑制(P0.05，P0.01)。42.2.2 吲哚美辛对 EA204 效应的影响(表 2)标本经吲哚美辛(10-5mol/L)预处理后，EA204(10-4310-4mol/L)舒张去甲肾上腺素收缩的兔离体主动脉环的作用受抑制(P0.01)。表 2 去甲肾上腺素收缩的兔离体主动脉环经阻断剂处理后对 EA204 舒张作用的影响（略）与对照组比较*P0.05，*P0.012.2.3 普萘洛尔对 EA204 效应的影响(表 3)标本经普萘洛尔(10-6mol/L)预处理后，对 EA204(110-5310-3mol/L)舒张氯化钾收缩的兔离体主动脉环的作用无影响。表 3 氯化钾收缩的兔离体主动脉环经阻断剂处理后对 EA204 舒张作用的影响（略） 3 讨论雌激素对妇女正常心血管功能的维持和调节具有重要的意义，是天然的血管保护剂，其对心血管的保护作用包括影响脂蛋白代谢的间接作用及对血管壁的直接作用4-6。雌激素对血管壁具有舒张作用，有研究发现给雌性和雄性大鼠及家兔的股动脉、胸主动脉、肠系膜动脉、子宫动脉和门静脉急性应用 17-雌二醇均能抑制高钾所致的各类血管收缩和肌球蛋白轻链的磷酸化，产生快速舒血管效应7。本研究发现雌酚酮衍生物 EA204 对兔离体主动脉具有显著的舒张作用，其舒张效应呈浓度依赖性。5氯化钡是内向整流型钾通道(KIR)阻滞剂，通过阻断 KIR，引起细胞膜去极化，增加电压依赖性钙通道开放，使钙离子进入细胞内增加8。高钾液通过激活电位依赖性 Ca2+通道(PDC)，使细胞外 Ca2+内流，引起血管收缩9-11。去甲肾上腺素通过激活受体操纵性 Ca2+通道(ROC)，除促进细胞外 Ca2+通过 ROC 内流外，主要引起细胞内贮钙库中的 Ca2+释放，两者都能使胞浆内游离 Ca2+浓度升高，在钙调素调控下引起血管平滑肌收缩12-13。本实验结果表明 EA204 可以浓度依赖性地抑制氯化钡、氯化钾、去甲肾上腺素引起的兔离体主动脉环的收缩，因此我们推测 EA204 舒张血管作用与电位依赖性 Ca2+通道、受体操纵性 Ca2+通道及 KIR 有关。NO-cGMP 系统信息通路是近年来研究较多的课题，NO 的作用主要是通过激活可溶性鸟苷酸环化酶实现的，NO 激活鸟苷酸环化酶，增加平滑肌细胞内的cGMP，激活 cGMP 依赖性蛋白激酶，使肌球蛋白轻链去磷酸化，而使血管平滑肌松弛14。亚甲基蓝是鸟苷酸环化酶抑制剂，加入亚甲基蓝孵育标本后，细胞内的鸟苷酸环化酶被抑制，cGMP 生成减少，而使血管平滑肌收缩。实验结果表明，加入亚甲基蓝预处理标本后，EA204 舒张兔离体主动脉环的作用被减弱，推测EA204 可能通过 NO-cGMP 途径发挥其舒张血管作用。前列腺素通过激活腺苷酸环化酶，增加平滑肌细胞内的 cAMP，产生舒血管效应15。花生四烯酸经环氧化酶作用生成前列腺素，吲哚美辛抑制环氧化酶的作用极强，因此可以减少前列腺素的生成，抑制血管平滑肌舒张。实验结果表明，加入吲哚美辛预处理标本后，EA204 舒张兔离体主动脉环的作用被减弱，提示EA204 可能通过前列腺素合成酶途径发挥其舒张血管作用。6本实验观察到 受体阻断剂普萘洛尔对 EA204 舒张兔离体主动脉环的作用无影响，提示 EA204 舒张血管机制与 受体无关。本研究表明 EA204 具有舒张血管平滑肌的作用，其作用机制与 NO-cGMP 途径、前列腺素合成酶途径有关，与 受体无关。【参考文献】1 Cooperwood JS.Selective estrogen receptor modulators：USP，11073087P. 2005：3-5.2 马佳佳，马恒，王跃民，等.葛根素对大鼠腹主动脉的舒张作用及其机制J.第四军医大学学报，2003，24(24)：2231-2234.3 Rika E，Yoshihiro T，Masahiro N，et al.Chronic treatment with 17-estradiol increases susceptibility of smooth muscle cells to nitric oxideJ.Eur J Pharmacol，2005，520：142-149.4 Walsh BW， Schiff I， Rosner B， et al. Effects of postmenopausal estrogen replacement on the concentrations and metabolism of plasma lipoproteinsJ.N Engl J Med，1991，325：1196-1204.5 Skafar DF，Xu R，Morales J，et al.Female sex hormones and cardiovascular disease in womenJ.J Clin Endocrinol Metab，1997，82：3913-3918.6 Shlipark MG，Simon JA，Vittinghoff E，et al.Estrogen and progestin，lipoprotein(a)，and the risk of recurrent coronary heart disease event safe menopauseJ.JAMA，2002，283(10)：1845-1852.7 Cruz MN，Douglas G，Gustafsson JA，et al.Dilatory responses to estrogenic compounds in small femoral arteries of male and female estrogen receptor-beta knockout miceJ.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(2)：823-829.8 Ferrer M，Marin J，Encabo A，et al.Role of K+ channels and sodium pump in the vasodilation induced by acetylcholine，nitric oxide，and cyclic GMP in the rabbit arotaJ.General Pharmacol，1999，33(1)：35-41.9 Paoletti R，Govonis.Classification of calcium antagonists：proposal of the WHO CommitteeJ.Pharmacol Res Commun，1987，19(2)：195-204.710 Breeman CV，Mcnaughton E.The separation of cell membrane calcium transport form extracellular calcium exchange in vascular smooth muscleJ.Biochem Biophy