1HPV 和 p16INK4A 与宫颈癌的关系研究进 展【摘要】 p16INK4A 基因决定着细胞周期的正常运转和细胞增殖、分化及凋亡，与人类多种肿瘤的发生发展有关。p16INK4A 在大多数原发肿瘤中缺失，但在宫颈癌及其癌前病变中的表达高低不一。高危型人乳头状瘤病毒（high risk human papilkmavirus,HR HPV）在宫颈癌发生发展过程中起着重要作用。本文对p16、HPV 在宫颈癌中的研究进展作一综述。 【关键词】 p16INK4A 人乳头瘤状病毒 宫颈癌 CIN宫颈癌在妇女各种恶性肿瘤中的发病率仅次于乳腺癌,位居第二，同时近几年呈现上升趋势。宫颈癌的发生是一个多因素、多步骤的长期过程，涉及多个基因的改变而引发细胞增殖失控。大量病因学研究证实宫颈癌的发生与高危型人类乳头状病毒感染有关。HR HPV 感染的宫颈癌及癌前病变组织中出现 p16INK4A 的异常表达，p16INK4A 与 HPV 感染在宫颈癌中的关系，已成为近年来研究的热点。1 HPV 的结构、功能及在宫颈肿瘤中的致癌机理HPV 是双链环形封闭的小分子 DNA 病毒，分子量 5000KD，直径为 55 nm，由 72 个壳粒构成的 20 面的衣壳体，无包膜，其基因在全长约 8kb,除一段调控序列（Long control region,LCR）外，其余组成 8 个基因，包括 6 个早期表达基因（E6、E7、E1、E2、E4、E5）和 2 个晚期表达基因（L2、L1）。L1 基因的 DNA 序列相对保守，被用作 HPV 鉴定和分型的依据。至今已有近百种 HPV 类型被分离确定。根据其致瘤性质，这些感染生殖道的 HPV 可分为高危型和低危型。 高危型 HPV2是指可以引起恶性肿瘤的 HPV，如引起宫颈癌的HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV58 等，而低危型 HPV 是指仅引起良性肿瘤的 HPV,如引起宫颈湿疣的 HPV6、HPV11 等。 高危型 HPV 的 E6、E7基因是病毒癌基因。E6 可结合多种蛋白，其中最重要的应是结合 p53 蛋白，并通过与之结合的 E6 AP 蛋白而活化泛素蛋白酶体途径降解 p53 蛋白1，使 DNA受损的细胞即不能修复 DNA 损伤，又不能发生凋亡，只能进行分裂繁殖。多次DNA 损伤在细胞内累积，是细胞遗传逐渐不稳定，发生越来越严重的异常重组，最终形成肿瘤。E6 蛋白使细胞永生化的另一个途径是增加端粒酶 hTERT 的活性2。E6 还可以通过 E6 AP 介导的 Blk(src 家族酪氨酸激活)蛋白的降解，使细胞1 持续分裂。此外，E6 还有增强外源 DNA 整合和细胞基因突变性，使中心粒异常和染色体不稳定，阻断干扰素的产生、结合并降低 p16 蛋白水平等功能及其它的生化特性。E7 蛋白约 100 个氨基酸，有三个保守区。E7 的中心功能就是通过三个保守区域之一与 Rb 蛋白家族（PRb、P107、P130）结合并通过泛素 26S 蛋白酶体途径降解 PRb 家族蛋白3，释放 E2f 蛋白使激活许多相关的 DNA 合成的蛋白因子，加快 DNA 复制和细胞的分裂繁殖，促进细胞的转化。E7 蛋白结合细胞周期素 A 和 E，及结合细胞周期素依赖蛋白激酶抑制物 P21 及 P27 的功能4。细胞周期素 E 活性提高和 P21 及 P27 功能下降能增强都能增强细胞周期依赖蛋白激酶的活性，从而使 Rb 蛋白过磷酸化二释放 E2f 蛋白，促进细胞周期的进展。此外，E7 蛋白还能结合如 P48 等 10 多种其它蛋白，可以提高外源性 DNA 整合的细胞基因突变性，诱导细胞凋亡，抑制 cdk 抑制蛋白，降解酪氨酸激酶 Blk,维持 HPV的游离环状结构，是染色体中心粒数目异常并形成非整倍体，激活 E2f 调节的分裂基因等4。综上所述,HR HPV 导致宫颈癌是以 E6 和 E7 基因表达和蛋白功3能的改变为中心，导致遗传基因损伤，最终发展为肿瘤。2 p16INK4A 基因结构、功能及在宫颈肿瘤中的异常表达2.1 p16INK4A 基因的结构及功能p16INK4A 基因又称多重肿瘤抑制基因（MTSI 基因）或 CDK4I 基因，是人们发现的第一个直接作用于细胞周期，抑制细胞分裂的抑癌基因。它定位于人类第9 号染色体短臂( 9p21 ) 上，全长 8.5 kb，由 3 个外显子和 2 个内含子间隔组成， 2 个内含子把 p16INK4A 的编码序列分为 3 个区：一个是 126 bp 的 5区，即外显子 1；一个是 307 bp 的中间区，即外显子 2；一个是 11 bp 的 3区，即外显子 3。编码分子量为 16569 的 p16INK4A 蛋白，p16INK4A 蛋白是细胞周期调节的重要成分，控制细胞的生长和分化，对细胞周期进行负调控，主要是抑制细胞从 G1 S期转变过程中起关键作用的 CDK4/CDK6 功能。CyclinD1 与 CDK4/CDK6 结合形成复合物, 能使视网膜母细胞瘤易感基因(即 Rb 基因, 为一种抑癌基因)的蛋白产物 pRb 磷酸化, 进而激活某些转录活化因子如 E2F (异源双体转录子) , E2F 则能活化 DNA 合成基因和细胞生长控制基因, 启动 DNA 合成, 使细胞由 G1 期进入S 期5。p16INK4A 基因的表达产物 P16INK4A 可与 CDK4 和 CDK6 结合，发挥负性调节作用, 共同完成对细胞增殖周期的调控。2.2 p16INK4A 在宫颈肿瘤中的异常表达 自 Kamb 首次报道黑色素瘤 p16INK4A 基因缺失后，相继又有一些学者在神经胶质瘤、肺癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌等研究中发现 p16INK4A 表达缺失。宫颈癌中 p16INK4A 的表达错综复杂。众多的研究表明宫颈癌中 p16INK4A 呈过表4达。研究表明6在 46 例宫颈腺癌中 p16INK4A 都呈过表达，而在邻近上皮和结缔组织中无表达；在 9 例宫颈良性病变和 5 例正常组织中无 p16INK4A 表达，可见 p16INK4A 可作为一个分子标志来区分宫颈腺癌和宫颈的良性病变。Braganca等7研究了 125 例宫颈病例，结果显示 99 例(79.2%)中 p16INK4A 呈阳性表达；p16INK4A 阳性率在宫颈高级别病变和低级别病变中有显著性差别。显示p16INK4A 基因参与宫颈病变的演进过程。显示随着宫颈病变级别的增加，p16INK4A 蛋白的表达随之增加,在宫颈癌中呈高表达。可能有以下几种机制；（一）p16INK4A 的过表达与 HPV 感染有关。一方面由于在 HR HPV 感染的宫颈癌组织中由于 HR HPV E7 蛋白结合 pRb，使其功能失活，解除了 pRb 对 p16INK4A蛋白表达的负反馈抑制，引起 p16INK4A 过表达8；另一方面可能由于在HR HPV 感染的宫颈癌组织中，HPV 病毒癌基因 E6 和 E7 通过整合进入宿主细胞染色体内，分别引起 P53、Rb 蛋白的功能失调，Rb 通路时失控，导致原本不正常的 p16INK4A 蛋白反馈性高表达，宫颈上皮细胞的细胞周期发生紊乱，使其具有永生性的特点而启动一系列癌变过程9。 （二）近年来的研究发现在宫颈癌发展中 p16INK4A 基因缺失或突变非常少见10 ,p16INK4A 基因主要的失活形式是启动子甲基化。徐军等11发现在正常组织中 p16INK4A 无甲基化，在CIN CINII/III 宫颈癌过程中，p16INK4A 基因启动子区甲基化阳性率逐渐升高，认为 p16INK4A 的过表达可能与 p16INK4A 基因启动区甲基化有关。Kim 等12研究发现，在宫颈癌的发生过程中，p16INK4A 基因甲基化率和 p16INK4A阳性表达率均呈上升趋势，认为在宫颈癌中过表达的 p16INK4A 是无功能的。 （三）p16INK4A 过表达可能是经过点突变或蛋白与蛋白之间的相互作用，导致 pRb 功能缺失，使得 Rb E2F 复合体的合成减少，胞内游离的 E2F 增多,进而导致5cyclinE 增多，使癌细胞通过 G1/S 转换点,进入 S 期。同时，游离的 E2F 增多，通过反馈作用使 cyclinD CDK 复合物表达增高，而后者又反馈刺激 p16INK4A, 使其表达量也随之增高13。也有少数国内外文献报道 p16INK4A 基因表达与宫颈癌发生呈负相关。阮永华等14发现 p16INK4A 在正常宫颈，CIN 和宫颈癌阳性表达率分别是100%，71.4%，21.6%，且表达有统计学意义，可见 p16INK4A 的表达在正常宫颈组织 CIN 宫颈癌呈逐渐下降的趋势。在宫颈腺癌15中有同样的报道。Agoff等16发现大量的中重度 CIN 中 p16INK4A 表达呈阴性，在一定程度上支持了在宫颈癌的发生发展过程中 p16INK4A 的表达呈下降的趋势，即在宫颈癌中p16INK4A 呈低表达。因为并不是所有的宫颈病变都有 HR HPV17引起，也并不是所有的 HR HPV 亚型和变异体都引起相同的细胞信号通路失调，或许肿瘤细胞的基因克隆演进过程中 p16INK4A 发生了丢失18。总之，宫颈癌中 p16INK4A 的表达程度报道不一，p16INK4A 蛋白在宫颈癌的发生、发展中所起的作用和作用机制可能与其在其它恶性肿瘤中不同。究其作用如何，即 p16INK4A 基因在宫颈癌中是否起重要作用，是扮演原癌基因角色或抑癌基因角色，以及作用机制如何，尚需进一步研究。3 在宫颈肿瘤发生发展中 p16INK4A 与 HPV 的关系 随着 HPV 在宫颈癌病因学中关键性地位的确立，多数学者 p16INK4A 在高危型 HPV（HR HPV）阳性的宫颈癌和癌前病变中过表达。在宫颈鳞状上皮中，p16INK4A 在 HR HPV 感染导致的宫颈癌及癌前病变中有过表达，而在 HPV 阴性的宫颈癌和正常组织中无表达。6Ekalaksananan 等19研究 186 例宫颈病变患者，发现宫颈高级别的病变和SCC 中都有 p16INK4A 的表达和 HPV 感染，在低级别的病变中二者所占的比例是 64%和 27%，在 ASCUS 中是 62%和 0%，在正常组织中是 7.4%和 3.4%。可见，p16INK4A 的表达与 HPV 的感染随着宫颈上皮内瘤变得级别进展而增加。国外学者20研究在 HPV 感染的病例中，p16INK4A 过表达在 LG SIL(低度的鳞状上皮内瘤变)向 HG SIL(高度的鳞状上皮内瘤变)组与 LG SIL 组比较时有显著性意义，在 LG SIL 组中，p16INK4A 的过表达与 HPV16 或 HPV18 感染无显著性意义，在 LG SIL 向 HG SIL 恶化的组中 p16INK4A 过表达与 HPV16 感染有显著性意义，而与 HPV18 感染无显著性意义，可见 p16INK4a 可以作为与 HPV 感染有关的宫颈恶性进展的分子标志。Ishikawa 等21发现在 HR HPV 阳性的病例中，32.4%（12/37）CIN，82.1%(32/39)CIN，93.2%(41/44)CIN，和全部的（16/16）SCC 中有 p16INK4A 过表达，在 CINI 和 CINII 中 p16INK4A 过表达率有显著性的不同、可见 p16INK4A 可作为一个分子标志来区分 HPV 感染宫颈病变级别高低，辅助临床诊断。在宫颈癌中，宫颈腺癌的发病率约占 5% 10%，且有逐年递增的趋势，但是宫颈腺癌及原位腺癌在筛查中常常被漏诊。Gioyanni 等22研究 45 例病例，发现所有病例都有 HR HPV 感染，免疫染色显示 26 例宫颈腺癌 p16INK4a 呈强阳性表达，4 例不典型增生宫颈腺中 p16INK4a 成灶状表达，反应性病变中 p16INK4a 呈阴性表达