1淫羊藿苷对体外培养的成骨细胞骨形态 发生蛋白2 表达的影响作者：柯勇， 张功礼， 禹志宏， 孔霞， 郭凌郧， 郑飞 【摘要】 目的:检测不同浓度淫羊藿苷（ICA）对体外培养的成骨细胞 MC3T3E1中骨形态发生蛋白2（BMP2）表达的影响。方法:分别用 10、20、40 ng/mL 的淫羊藿苷作用 MC3T3E1 细胞，观察细胞生长情况；MTT 法测绘细胞生长曲线；FCM 法测定细胞生长周期；免疫细胞化学方法和 Western bloting 测定细胞BMP2 蛋白表达情况。结果:淫羊藿苷组可使细胞的生长曲线明显上移，S 期细胞百分率升高,G1 期细胞百分率减少以及 BMP2 蛋白表达量增加，其中 20 ng/mL 组作用更为显著，各组间比较有显著差异（P0.01）。结论:淫羊藿苷可以促进成骨细胞增殖，增加成骨细胞 BMP2 的表达。 【关键词】 成骨细胞；骨形态发生蛋白2；淫羊藿苷Abstract：Objective To explore the effect of icariin on the expression of Bone Morphogenetic Protein2 in MC3T3E1 cells.Methods MC3T3E1 cells were incubated with different concentrations of icariin (10 ng/mL,20 ng/mL,and 40 ng/mL,respectively).MTT method was used to observe the cell proliferation.The cell growth cycle was detected by flow cytometry.The expression of BMP2 in MC3T3E1 cells was examined by immunohistochemistry staining and western blotting. Results Icariin made the growth curve of MC3T3E1 cells elevated and increased the percentages of Sphase cells,and decreased the percentages of G1phase cells,especially in 20 ng/mL icariin group,and these parameters were significantly different among these groups(P0.01).Icariin increased the expression of BMP2 in a concentrationdependent manner,with 20ng/mL icariin being the most obvious.Conclusion Icariin can promote cell proliferation and increase the expression of BMP2 in MC3T3E1 cells.Key words：Osteoblasts；Bone Morphogenetic Protein2；Icariin2淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿主要有效成分之一。现代中药药理学认为淫羊藿具有补肾壮阳，益精健骨的功效，其主要化学成分为黄酮类化合物，包括淫羊藿苷、淫羊藿次苷、脱水淫羊藿素等1。转移生长因子（Transforming growth factor,TGF）超家族对成骨细胞的形态学发生、增殖、分化和凋亡中起重要作用2,骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMP）是转化生长因子( TGF)超家族中的一组多功能细胞因子，具有诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，最终导致软骨、骨形成的作用，体内和体外实验都证明 BMP2 有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力3。临床应用淫羊藿防治骨质疏松（Osteoporosis，OP）已取得明显疗效4,但淫羊藿苷对成骨细胞调节机理以及淫羊藿苷对生长因子表达的影响报道甚少。本实验旨在研究淫羊藿苷对成骨细胞 BMP2 表达的影响，探讨其促进成骨细胞生长的机制。1 材料和方法1.1 细胞株MC3T3E1 细胞购自中国医学科学院细胞中心。用含 10%胎牛血清的 MEM培养基（GIBCO 公司）在含 5%CO2、37 饱和湿度培养箱传代培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。1.2 药物和试剂淫羊藿苷（纯度 99.99%，北京市药物检验所）。用 0.01%的 DMSO(二甲基亚枫)溶解制得淫羊藿苷母液，浓度为 1 g/mL，4 冷藏备用。BMP2(N14)多克隆抗体（SANTA CRUZ 公司）；辣根酶标记兔抗山羊 IgG（北京中杉试剂公司）；FITC 标记3的兔抗山羊 IgG（北京康倍斯试剂公司）；FBS 胎牛血清和 MEM 培养基 （GIBCO 公司）。1.3 MTT 试验及实验分组按照 ICA 药液浓度试验分为 4 组：空白对照组，淫羊藿苷（ICA）低、中、高剂量组，各组 ICA 药液浓度分别为：10、20、40 ng/mL。取第二代传代培养的 MC3T3E1细胞，制成 5103 个/mL 细胞悬液，每孔 200 L 接种于 96 孔培养板中，每组设 4个复孔，共接种 5 板，在 37 、5% CO2 条件下培养。24 h 后换入含 ICA 药液的培养基，继续培养 24,48,72，96 h 后测定 OD 值。在各测定时间点结束前 4 h 每个孔加入 MTT 20 L，终止培养后每孔加入 150 L DMSO，水平振荡 10 min 后用酶标仪 490 nm 波长测定吸光度(A)，根据测得的 OD 值绘制生长曲线。1.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞生长周期以 1105 个/mL 浓度定量接种到细胞培养瓶中，24 h 后按实验分组分别换入含不同浓度 ICA 药液的培养基继续培养，48 h 后收集细胞，用 70乙醇 4 固定 12 h，离心，弃乙醇，加入 RNA 酶 37 温育，30 min 后加入 PI 避光、4 继续孵育30 min。流式细胞仪检测细胞周期中(GO/G1、S、G2/M)各时相细胞占细胞总数的百分比（），每组重复 3 次，CellQuest 及 Motifl 软件进行数据分析。1.5 荧光免疫细胞化学染色（FITC 标记）在 37 、5%CO2 条件下培养，细胞生长至约全层的 80，弃去培养基，4多聚甲醛固定。免疫细胞化学染色严格按照试剂盒步骤进行，细胞核用 DAPI 染色剂复染。荧光显微镜下观测结果，发出绿色荧光的细胞为阳性细胞，使用 Image J 软4件分析荧光强度,将所得数据进行统计学比较。1.6 蛋白免疫印迹试验（Western Bloting）72 h 后收集各组细胞，加入细胞裂解液，置冰上 30 min，100 水浴锅中煮 10 min,冰上 10 min,15 000 r/min 离心 5 min,取上清，紫外线分光光度计定量后置20 备用。灌制 10%SDS聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1200）,4 孵育过夜，二抗（1100）,室温孵育 2 h，ECL 显色。以各条带的吸光度值与 actin 吸光度值的比值比较各组 BMP2 蛋白表达。 1.7 统计学分析所有数据以均数标准差(xs)表示，SPSS 13.0 统计软件进行单因素方差分析，P0.05 为差异有统计学意义;制图采用 Sigma Plot 8.0 统计软件。2 结果MTT 结果表明，在不同时间点以 ICA 20 组 OD 值最高，较其他各组明显增高（P0.01）；ICA 10 组 OD 值较对照组、ICA 40 组明显增高（P0.01）；对照组、ICA 40 组间无显著性差异（P0.05）。以 5d 的 OD 值绘制各组的细胞生长曲线见图 1。 FCM 结果表明 ICA 组均可使 MC3T3E1 S 期细胞百分率升高,G1 期细胞百分率减少，其中 ICA 10 组、ICA 20 组作用更为显著（P0.01），ICA 40 组与对照组间无显著性差异（P0.05）（表 1）。DAPI 标记的 MC3T3E1 细胞核呈蓝色荧光，而免疫细胞化学染色 BMP2 蛋白表达呈现出绿色荧光，阳性表达分布在胞浆内，胞核不着色，ICA 10 组、ICA 205组阳性细胞数较对照组、ICA 40 组明显增多，荧光强度增强（图 2）。 表 1 不同浓度 icariin 对 MC3T3E1 细胞周期分布的影响(%) Western Bloting 结果显示，ICA各组在 31KD 均出现目标条带表达，其中 10 ng/mL 组、20 ng/mL 组 BMP2 蛋白量随 ICA 浓度增加而增加，呈剂量依赖性特点；40 ng/mL 组 BMP2 蛋白表达量较对照组略有增加，但较 10 ng/mL 组、20 ng/mL 组低（图 3）。图 3 不同浓度 ICA 作用 MC3T3E1 细胞BMP2 表达电泳图3 讨论成骨细胞的分化是骨发生、骨形成的前提，骨组织不断经历破骨细胞对旧骨吸收和成骨细胞形成新骨的过程,使骨更新并保持形态结构完整性。在正常骨形成、重建过程中,破骨细胞和成骨细胞各自维持一定的数量,互相制约,对生物刺激产生相应的反应,处于偶联状态，进行更新以维持体内骨代谢平衡5。淫羊藿作为中药历史悠久，李时珍在本草纲目中记载其有“益精气，坚筋骨，补腰肾，强心力”功效。淫羊藿作用广泛,对心血管系统、中枢神经系统、免疫系统、抗 OP、抗衰老等方面均有不同疗效。现代药理学研究证实,淫羊藿具有性激素样作用,能促进骨髓细胞 DNA 合成,促进骨组织蛋白质合成及成骨细胞生长。由淫羊藿组成的复方制剂在抑制骨质丢失、改善 OP 症状方面有明显疗效6；单味淫羊藿对去势、维甲酸、羟基脲、激素等所致的骨质疏松动物模型亦表现出较好的防治作用7。体外实验也证实淫羊藿可以抑制破骨细胞的分化和吸收8。本实验通过用不同浓度淫羊藿苷的血清对 MC3T3E1 成骨细胞株进行体外培6养，观察细胞生长情况，及细胞在淫羊藿苷刺激下的增殖能力和 BMP2 蛋白表达。结果表明，淫羊藿苷可以促进 MC3T3E1 细胞增殖，增强成骨细胞 BMP2蛋白表达量。淫羊藿主要化学成分为淫羊藿苷，属于黄酮类化合物，具有性激素样作用。但是否还有其它有效成分以及其它有效成分是否与淫羊藿苷在体内产生化学作用其机制未明。成骨细胞的分化调控在体内受多种激素及生长因子的影响,其主要生长因子有结缔组织生长因子(CTGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、DLL 基因同源异型盒基因(DLX5)、Runt 相关转录因子(Runx2)、Y 性别决定域基因(Sox9)、转化生长因子 (TGF)、肿瘤坏死因子 (TNF)等，并且这些生长因子在调控过程中相互联系，相互影响9。BMP2 有很强的促进成骨细胞分化和诱导体外成骨的能力，被认为是 TGF家族中活性最高且唯一能单独诱导成骨的因子，其高表达可以促进成骨细胞的增殖与分化10。SMADS 是 TGF 超家族的下游信号传导通路，Smad 4 作为SMADS 的公共递质在 SMAD 家族成员中十分重要，是 TGF 家族成员在细胞内传导的必经之路11。体外成骨细胞培养实验证实淫羊藿苷对成骨细胞 Smad 4 mRNA 的表达有明显促进作用12。本实验结果表明淫羊藿苷可能通过上调 BMP2 的表达,通过 SMADS 细胞信号传导通路，BMP2 与细胞周期依赖性蛋白 D 形成复合