桃果实成熟软化机理的研究桃果实成熟软化机理的研究阚 娟（扬州大学 食品科学与工程学院）摘要：摘要：果实在采收后仍然是活的有机体，在贮藏过程中会发生不断的软化现象。本文就桃果实成熟软化方面的进展进行了综述，介绍了与果实成熟软化过程细胞壁多糖物质的降解以及相关的胞壁酶以及植物激素等在果实成熟软化过程中含量的变化和作用，并对软化机理进行了探讨。关键词：关键词：果实，成熟，软化桃是典型的呼吸跃变型果实，呼吸跃变型果实成熟时最显著的变化特征就是果肉的软化。果肉的软化一方面使果实的适口性和风味发生变化，达到最理想的食用状态，但另一方面果实软化后更容易受到物理伤害和病原浸染，从而造成使贮藏寿命的缩短。桃果实成熟软化是一个非常复杂的过程，期间经历了一系列生理生化变化，包括细胞壁的降解、内含物的变化、呼吸速率以及其他的代谢变化。综合近几年的研究进展，本文就桃果实软化过程中分子的含量变化情况和作用作一综述。1.果实成熟软化过程中细胞壁多糖及其相关酶的变化果实软化是大量细胞壁多糖物质的降解以及细胞壁结构的丧失，导致细胞发生分离所致1。果实细胞壁的主要成分为果胶质、半纤维素和纤维素等多糖类，还有少量的蛋白质。果实细胞壁多聚体之间的相互作用主要依靠具体的化学键，也可以因分子链长而通过机械作用交缠在一起，形成果胶纤维素半纤维素（PCH）共同伸展的网络状结构。细胞壁多聚体网络的松懈是以细胞壁分解酶的作用为基础，通过交联的断裂或者通过多聚体链的切开造成。1.1 细胞壁多糖成分的变化果实细胞壁多糖的极端异质性使得将多糖的增溶、解聚和各单糖组分的损失与某一特定的多糖组分的改变联系在一起是不可能的。异质性包括分子量、单糖组成、糖键、分支程度和侧链的长度等2。1.1.1 果胶（pectin） 果胶是许多高等植物细胞壁中含量最丰富的多糖成分，也是构成细胞初生壁和胞间层的主要成分。细胞壁果胶参与胞壁细胞之间的粘连，主要通过Ca2+与细胞壁中胶层中部分去酯化的半乳糖醛酸聚糖连接在一起3。Fisher 认为，果胶的溶解是最根本和最重要的果实成熟特性4。在很多果实的成熟软化过程中，包括甜瓜、鳄梨、柿子、猕猴桃和梨等，胞间层和细胞壁中普遍发生果胶的解聚或增溶。果胶长链解聚或缩短，可溶性果胶含量增加，多聚体中甲基去除（去酯化） 。果胶的降解会增加细胞壁交联网络的细孔大小，导致细胞壁膨胀，使底物更容易受到酶的作用。 1.1.2 半纤维素（hemicellulose） 果实细胞壁多糖物质去除果胶之后，用浓度逐渐加大的碱液提取的是连接逐渐紧密的半纤维素多糖。半纤维素多糖包括木葡聚糖、阿拉伯半乳聚糖、鼠李半乳糖醛酸聚糖、葡糖甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，它们以共价键连接到果胶或以氢键连接到纤维素上。虽然细胞壁中半纤维素的量变化不大，但研究表明许多果实成熟过程中半纤维素的分子量明显变小。在番茄、柿中，半纤维素的解聚仅发生在紧密连接的半纤维素多糖中，松散连接的半纤维素中较少解聚5，而在瓜等果实中，半纤维素多糖的解聚在连接紧密和松散的多糖中均有发现。随着果实成熟软化，果胶和半纤维素的表观分子量发生变化，导致细胞壁结构变化，降低组织的粘合力。桃果实果胶和半纤维素提取物表观分子量的改变的复杂性意味着一些能够降解成熟期果胶和半纤维素成分的不同的酶在起作用6。 1.1.3 纤维素（cellulose） 纤维素是葡萄糖单元的-(14)连接的线形长链。细胞壁纤维素微丝是包埋在非纤维素多糖和蛋白质的致密基质中的。尽管有人预计纤维素结构的变化可能与果实的成熟软化有关，但是对许多果实的研究的结果表明，纤维素的解聚并不是软化的关键因子7。对纤维素葡聚糖水平的化学分析表明梨和番茄成熟过程中纤维素水平保持恒定或略有增加。用13C固态NMR方法研究猕猴桃果实成熟过程中纤维素多糖的变化，发现即使果实细胞壁充分解离的时候，纤维素微管组织结构仍没有发生改变。 1.2 果实成熟软化过程中细胞壁多糖各单糖含量的变化 构成果实细胞壁的多糖中有二十多种单糖，常见的有8种。三种己糖：D-葡萄糖、D-半乳糖和D-甘露糖。两种戊糖：L-阿拉伯糖和D-木糖。一种醛酸：半乳糖醛酸（半乳糖6位上的-CH2OH被-COOH取代） 。还有两种常见但含量低的糖：L-鼠李糖（甘露糖6位上的-CH2OH被甲基取代）和L-岩藻糖（半乳糖6位上的-CH2OH被甲基取代） 。几乎所有的糖常为吡喃糖式，即一种六员环，但阿拉伯糖常为呋喃式的五员环。果实成熟软化过程中最为常见的是细胞壁酸性半乳糖醛酸和阿拉伯糖、半乳糖等中性糖的降解，现分述如下。 1.2.1 半乳糖醛酸 果实中半乳糖醛酸主要存在于果胶多糖中，是构成果胶多糖主链的主要单糖成分。多聚半乳糖醛酸最初合成并与细胞壁连接在一起时是高度甲酯化的，随着果实的成熟软化，在果胶甲酯酶的作用下，甲酯化程度不断下降，多聚半乳糖醛酸只有经去酯化作用后才能在多聚半乳糖醛酸酶的作用下发生降解，导致半乳糖醛酸单糖的降解和多聚糖醛酸的解聚。多聚半乳糖醛酸的降解在不同果实种类之间有一定的差异，在草莓、香蕉、苹果中未检测到或很少有多聚半乳糖醛酸的降解和多聚糖醛酸的解聚。在甜瓜、梨和番木瓜中多聚半乳糖醛酸的降解相对较少。果实成熟过程中细胞壁半乳糖醛酸降解、多聚糖醛酸解聚程度最大的是鳄梨，在果实完熟期间，多聚糖醛酸仅以极低的分子量存在。 此外，在不同的果实种类中，半乳糖醛酸主要发生降解的果胶组分也不相同。甜瓜半乳糖醛酸的大量降解主要发生在水溶性果胶中。番茄，溶质桃等果实半乳糖醛酸的大量降解主要发生在鳌合剂溶性果胶中。猕猴桃中半乳糖醛酸的大量降解，多聚糖醛酸的大量解聚也有报道，这种降解主要发生在苯酚-乙酸-水溶性组分中。但Giovannoni等人通过不能正常软化的转基因番茄试验证明，半乳糖醛酸的降解并不是果实软化的决定因素8。果实的成熟软化可能还有细胞壁其他成分降解的参与。 1.2.2 半乳糖与阿拉伯糖 半乳糖与阿拉伯糖对细胞壁的结构与功能有着重要的作用。豌豆生长发育过程中1,4-半乳糖含量与子叶细胞壁的硬度呈明显的正相关9。细胞壁多聚物中半乳糖残基的丧失也是果实成熟过程中细胞壁最大的变化之一。番茄果实中聚合态半乳糖含量的减少和游离态半乳糖含量的增加在果实成熟早期就已开始。甜瓜成熟过程中，半乳糖降解了将近80。 末端阿拉伯糖残基广泛分布于果胶和半纤维素多糖中，如阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯木聚糖、阿拉伯木葡聚糖以及葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖等。Iwai等人研究认为果胶侧链阿拉伯糖残基对细胞壁多糖或细胞壁结构的稳定性有重要的影响10。Yamaki等人报道称细胞壁阿拉伯糖的丧失与日本梨果实的成熟有密切的联系。对桃果实的研究得出，正常成熟的果实中细胞壁松散连接和紧密连接的多糖中均有阿拉伯糖的大量损失，但在受到冷害不能正常成熟的桃果实中，阿拉伯糖的损失仅发生在与纤维素牢固连接的多糖成分中11。无色、不能正常成熟并发生软化的番茄突变体（Cnr）果实细胞壁多糖中，含有大量的连接紧密的阿拉伯糖残基。苹果中阿拉伯糖含量在果实过熟期间迅速下降，而且粉质苹果在采后贮藏过程中也检测到细胞壁多糖中阿拉伯糖残基的损失。 1.3 果实细胞壁多糖水解酶的研究果实成熟过程中初生细胞壁分子组成是在各种细胞壁多糖降解酶的调节作用下，随时间和空间的变化而变化的4。在各种细胞壁多糖降解酶的作用下，果实细胞壁多糖发生降解，高聚物解离，细胞壁组织变软，果肉软化。近年来，果实成熟软化过程中多糖的降解已发现是在多种多糖降解酶的参与下进行的，现分述如下。 1.3.1 多聚半乳糖醛酸酶 (PG)PG是催化半乳糖醛酸键水解断裂的酶，有外切-（exo-）和内切-（endo-）两种作用类型。果实成熟相关的exo-和endo-PG在果实中均有发现。 周培根等用海复早桃和白云两个品种研究发现，PG活性与果实软化关系极为密切，但他们同时也发现桃成熟期间果实硬度下降明显地早于并且快于水溶性果胶含量和PG活性的增加，表明桃果实软化除上述因素以外还与其它因素有关。 Smith等人采用反义RNA方法，将番茄果实中的PG活性抑制为仅为野生型番茄的0.5，但果实乙烯的释放并未受到抑制，果肉也依然发生软化。关于PG在桃果实软化中的作用还需从分子水平做进一步的研究。1.3.2 果胶甲酯酶 (PME)PME作用于多聚半乳糖醛酸的半乳糖醛酸残基的C-6羧基基团，去掉甲酯，催化果胶酯酸转化为果胶酸，更适于PG的解聚。在果实的成熟衰老过程中，PME活性增加，因此认为PME对果实软化可能起着一定的调节作用。周培根84等在桃上的研究发现，在桃的成熟后期，PME活性较高。这些研究表明PME可能参与了果实成熟软化的进程。 转基因反义PME番茄果实中果胶甲酯化程度在成熟过程中比野生型高15-40，但是，根据果实乙烯释放量和番茄红素产生的量可以得出，果实仍然正常成熟。PME活性可能对果实成熟过程中果肉的软化并没有直接的作用，其作用可能主要是推动PG的作用，进而影响果实衰老过程中组织完整性的降低。从这一意义上来说, PME对桃果实软化也可能起到间接的调节作用。1.3.3 -D-半乳糖苷酶 （-GAL）-GAL也有内切-（endo-）和外切-（exo-）两种作用形式，但在高等植物中，尚未检测到endo-GAL。该酶从-D-半乳聚糖支链非还原末端切除-D-半乳糖残基。鼠李半乳糖醛酸聚糖中半乳糖苷聚糖侧链以及木葡聚糖侧链末端半乳糖残基都有可能是细胞壁-GAL的作用底物。有关-GAL在果实软化中的重要作用已在香瓜、番茄、苹果、李、杏、桃等许多果实中得到证实。陈昆松等对猕猴桃的研究结果表明，-GAL与果实的后期软化有关。Andrew等研究认为-GAL对甜樱桃果实成熟软化过程中细胞壁的水解起作用。Nunan对葡萄的研究结果表明，-GAL活性及其mRNA含量的增加与细胞壁中型阿拉伯半乳聚糖含量的降低有着密切的联系。Smith等人采用反义抑制相关基因表达的方法证明，TBG4基因编码的-半乳糖苷酶对果实的软化进程有着重要的作用。目前已从番茄、苹果和梨等植物中克隆到了-GAL基因，利用基因在转录和翻译水平上的研究，有助于进一步阐述该酶在果实软化中的作用。 1.3.4 -L-阿拉伯呋喃糖苷酶 （-AF）-AF（EC 3.2.1.55）是一种能够水解非还原呋喃阿拉伯糖残基的糖苷酶类，由于果实成熟过程中常常伴随着阿拉伯糖的丧失，该酶活性在果实成熟软化中的作用近年来引起了人们的重视。Tateishi对日本梨的研究结果表明，-AF属于糖苷酶家族，离体条件下具有一定的-木糖酶活性，能降解-D-木聚糖。但该酶在果实成熟软化过程中，只具有降解阿拉伯糖的功能，而不能降解木糖。 近年来的研究表明，该酶活性对日本梨、苹果、鳄梨、番茄、柿、桃等果实成熟过程中的软化有重要作用。Sozzi从番茄果实中分离出-AF的同工酶，并报道了它们各自的激素调节特征以及在果实发育成熟中的作用。该酶中的一种同工酶的活性受乙烯的调节，能从果胶多糖中降解阿拉伯糖残基，这表明该同工酶对番茄果实成熟过程中阿拉伯糖的代谢起着重要的作用。已有研究表明，乙烯在-AF基因的表达过程中起着重要作用，乙烯能影响-AF mRNA的翻译或激活-AF原蛋白。对此，从分子生物学水平有待进一步探讨。1.3.5木葡聚糖内糖基转移酶(XET)木葡聚糖是一种细胞壁的结构多糖，为双子叶植物细胞初生壁中的主要半纤维素，它紧密地结合到纤维素地微纤丝上，并通过束缚相邻地微纤丝，对细胞壁地膨胀起限制作用，在研究豌豆茎地伸长时发现，木葡聚糖的酶切断裂可使细胞壁膨胀疏松，从而促进了细胞生长。XET具有内切和连接的双重效应，在切开木葡聚糖侧链后，可将断链转移到另一个受体链上去，即把切口新形成的还原末端与另一个木葡聚糖(受体)分子的非还原未端相连接起来，这一