简答题：简答题： 1. 基因工程的基本过程基因工程的基本过程：获取目的基因重组体的制备重组体的转换重组体筛选和鉴定 外源基因在宿主细胞中的表达 2. 基因工程的基本原理基因工程的基本原理：提高外源基因的剂量分子遗传学原理筛选修饰重组基因表达的转 录调控元件，如启动子、增强子等分子生物学原理修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元 件-分子生物学原理基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产-生化工程学原理。 3. DNADNA 重组载体的功能重组载体的功能：为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源基因提供在受体细 胞中的复制能力或整合能力为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力 4. DNADNA 重组载体所具备的的条件重组载体所具备的的条件：具有对受体细胞的可转移性或亲和性，以提高载体导入受体 细胞的效率具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点，使得外源基因在受体细胞中 稳定遗传具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，有利于外源基因的剪接插入。 5. 质质粒的分类、用途及区别粒的分类、用途及区别：克隆质粒：常用于克隆和扩增外源基因测序质粒：通常高拷贝 复制，含有多酶切口的街头片段，便于各种 DNA 片段的克隆与扩增整合质粒：含有整合酶编 码基因及整合特异性的位点序列，克隆在这种质粒上的外源基因进入细胞后，能准确地重组整 合在受体细胞染色体 DNA 的特定位点上。穿梭质粒：含有两个亲缘关系不用的复制子结构以 及相应的选择性标记基因，能在两种不同种属的受体细胞中复制检测探针质粒：被设计用来 筛选克隆基因的表达调控条件表达质粒：使克隆在合适位点上的任何外援基因均能在受体细 胞中高效表达 6. 噬菌体和噬菌体和 CosCos 质粒区别质粒区别：黏粒重组分子进入受体细胞后，依靠质粒 DNA 部分的复制子结构 进行自主复制，其拷贝数取决于质粒本身的性质，而且由于重组分子失去了体内包装的能力， 故其分离纯化只能采用质粒的方法。 7. T T4-DNA4-DNA 连接酶的生物活性连接酶的生物活性：修复双链 DNA 上的单链缺口连接 RNA-DNA 杂交双链上的 DNA 链缺口或 RNA 链缺口连接完全断开的两个平头双链 DNA 分子。 8. T4-DNAT4-DNA 的修饰性活性的修饰性活性：5 3的 DNA 聚合活性3 5的核酸外切酶活性无 5 3的核酸外切酶活性。类酶类酶（最常用 于 DNA 重组）类酶酶分子三亚基双功能酶内切酶和甲基化酶不 在一起三亚基双功能酶识别位点二分非对称序列4-6bp 短序列，大多 数为回文结构5-7bp 非对称序 列 切割位点距离识别位点至少 1000bp，无特异性在识别位点中或靠近 识别位点在识别位点下游 24-26bp 处 限制反应与甲 基化反应互斥分开的反应同时竞争限制作用是否 需要 ATP需要不需要需要9. KlenowKlenow 酶的生物活性酶的生物活性：5 3的 DNA 聚合活性，使 DNA 链在模板的指导下延伸3 5的核酸外切酶活性，其主要功能是识别并切除错配的碱基，保证 DNA 复制的准确性无 5 3的核酸外切酶活性无核酸内切酶活性 10. KlenowKlenow 酶的副反应即催化活性酶的副反应即催化活性：修复由限制性核酸内切酶造成的 3凹端，使之成为平头 末端以含有同位素的脱氧核苷酸为底物，对 DNA 片段进行标记用于催化 cDNA 第二链的合 成用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列 11. 受体细胞的类型及其特点受体细胞的类型及其特点：限制缺陷型：打破细菌转化的种属特异性，提高任何来源的 DNA 分子的转化效率。重组缺陷型：具有依赖于 ATP 的双链 DNA 外切酶和单链 DNA 内切酶双重活 性，用于以外源基因克隆、扩增以及表达为目的的基因工程实验。转化亲和型：利用遗传诱 变技术改变受体细胞壁的通透性，提高转化效率遗传互补型：具有与外源基因表达产物活性互补的遗传特征感染寄生缺陷型：对其他生物具有感染和寄生效应，将重组 DNA 分子导入后， 极有可能随着受体菌的感染寄生作用，进入生物体，并广泛传播。 12. 以植物为例，常用的转基因方法（以植物为例，常用的转基因方法（1414 种）种）细胞融合微细胞介导的基因转移染色体介导 的基因转移脂质体介导的基因转移磷酸钙沉淀介导基因转移原生质体融合术显微注射 法电脉冲介导的基因转移重组 DNA 病毒感染重组 RNA 病毒感染直接转化法接合转移 法超声波法基因枪法每种方法要懂得基因转移大概的原理，不能单纯只知道名字。 13. 大肠杆菌作为转基因受体的特点大肠杆菌作为转基因受体的特点：优点：全基因组测序，共有 4405 个可读框基因克隆 表达系统成熟完善繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国 FDA 批准为安全的基 因工程受体生物。缺点：缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修 饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒 素 14. 作为一个真核生物表达系统，酵母的优势作为一个真核生物表达系统，酵母的优势：全基因测序，基因表达调控机制比较清楚，遗 传操作简单；具有原核细菌无法比拟的真核生物蛋白翻译后修饰加工系统；不含有特异性 的病毒，不产生毒素；大规模发酵工艺简单，成本低廉；能将外源基因表达产物分泌至培 养基中；酵母是最简单的真核生物（划线部分为：酵母与大肠杆菌之间的比较） 15. 异源蛋白异源蛋白形成包含体的主要原因形成包含体的主要原因：表达速度过快造成细菌细胞内瞬时间蛋白浓度过高肽段或 氨基酸之间在分子力的作用下不能构成正确的结构，培养温度不合适，异源蛋白中个别氨基酸 序列不能在寄主细胞中正确表达不能构成正确的结构，寄主本身某些蛋白缺失，e.g.热休克蛋 白。膜蛋白。 16. 包含体的优、缺点包含体的优、缺点：优点：能简化外援基因表达产物的分离操作能在一定程度上保持 表达产物的结构稳定缺点：丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作。体外复 性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%。 17. 信号肽的识别蛋白信号肽的识别蛋白（大肠杆菌，真菌信号台如何与表达载体结合运输表达）;信号肽合成出来， 马上就被核糖体蛋白上的信号肽识别颗粒(SRP)特异性的结合，这一结合可以被 SRP 的受体捕 获，并将正在进行翻译的核糖体固定在膜内侧。SRP 是一个由蛋白与 RNA 组成的复合物。 18. 包含体复性操作的方法包括包含体复性操作的方法包括：一步稀释法，蛋白复性与浓度无关，但集聚与浓度关系很大 分段稀释法，逐步降低变性剂的浓度，防止二次集聚的发生试剂添加法，精氨酸、甘氨酸、 甘油、蔗糖、PEG、Ca2+蛋白修饰法，氨基柠檬酸酐酰化，蛋白带负电，抑制集聚产物隔 离法，将变性的蛋白分子固定化，避免其相互碰撞分子伴侣法，GroELL、GroES、DnaK，固 定化，共表达 19. 二硫键错配造成的危害二硫键错配造成的危害：二硫键错配会使得多肽链中的巯基严重的集聚。 20. 二硫键如何恢复二硫键如何恢复：化学氧化法：需要电子受体，最廉价的电子受体为空气，二硫键形成是 随机的，仅适用于那些不含游离半胱氨酸残基的蛋白质的重折叠二硫键交换法需要还原型和 氧化型谷胱甘肽，二硫键形成相对特异，因此适用性较广，重折叠效果好。 21. 泛素依赖型蛋白降解泛素依赖型蛋白降解：在泛素依赖型的蛋白质降解途径中，这个蛋白因子的 C 端 Leu-Arg- Gly-Gly 序列首次与各种靶蛋白的游离氨基基团形成共价结合物，这些结合物在泛素激活酶 E1、泛素运载酶 E2 以及泛素连接酶 E3 的作用下依照一定路线降解为短小肽段直至氨基酸。 （P160） 22. 泛素在蛋白质降解中的作用泛素在蛋白质降解中的作用：以分泌的形式表达重组异源蛋白，异源蛋白在与泛素形成共 价结合物之前，迅速被转位到分泌器中，即可有效避免降解作用；将外源基因的表达置于一 个可诱导的启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表达，分子数占绝对优势的表达产 物便能逃脱泛素的束缚，从而减少由降解效应带来的损失；使用泛素生物合成缺陷的突变株 作为外源基因表达的受体细胞。 23. 线状质粒结构特点线状质粒结构特点：（主要是两端）缺少经典的启动子结构，因此质粒上的基因转录需要自 身编码的 RNA 聚合酶，可读框上游都没有酵母核 RNA 聚合酶的识别位点，但在转录起始位点上 游 14bp 处含有一个 ACT(A/T)AATATATGA 的保守序列（UCS），这是质粒编码的 RNA 聚合酶的专 一性识别结合位点，但这种质粒来源的 RNA 聚合酶基因的表达仍需使用宿主细胞的转录系统。 24. 用于酵母的显性筛选标记用于酵母的显性筛选标记 常见于哪个宿主常见于哪个宿主？ 蛋白质基因类型说明 氨基糖苷磷酸 转移酶Aph （Tn601）抗氨基糖苷 G418 氯霉素乙酰转 移酶CAT （Tn9）抗氯霉素在不可发酵的碳源上生长，ADC1 启 动子二氢叶酸还原 酶Dhfr减少氨甲蝶呤 和磺胺的抑制异-1-细胞色素 c 启动子未定性Ble抗草霉素异-1-细胞色素 c 启动子、LEU2 启动 子 铜离子螯合物CUP1抗铜离子自身启动子 转化酶SUC2蔗糖的作用AOX1 启动子、XPR2 启动子乙酰乳酸合成 酶ILV2 r抗硫酰脲除草 剂自身启动子EPSP 合成酶AroP抗草甘膦ADH1 启动子、CYC1 终止子 25. 蛋白质分泌过程蛋白质分泌过程：新合成的分泌型蛋白质在翻译过程中进入内质网膜腔新生肽链的 N 端 与信号肽识别颗粒（SRP）形成复合物，抑制肽链的延长SRP 复合物与内质网膜外表面的 SRP 受体特异性结合新合成的多肽链在 N 端信号肽的作用下穿过内质网膜，进入内腔，同时被信 号肽酶专一性切除信号肽新生肽链的合成重新进行。在内质网内腔中的寡聚多糖核装配 进入高尔基体的分泌性蛋白在其寡聚多糖核上进行外链的延伸反应，最终形成全糖基化的分泌 型蛋白质。分泌蛋白在胞芽集中，通过膜融合作用转入至分泌型泡囊中泡囊将蛋白质运输 至细胞膜内侧，在 GTP 结合蛋白复合物的作用下，与细胞膜发生融合，将蛋白质释放到细胞周 质中。 26. 将外源基因导入动物细胞的方法将外源基因导入动物细胞的方法：装基因的动物受体细胞系统、动物细胞物理转化法（磷酸 钙共沉淀法、电击法、脂质体包埋法、DNA 显微注射法）、动物病毒转染法、工程胚胎干细胞 法、体细胞转基因克隆法。 27. 腺病毒结构（重点）腺病毒结构（重点）：为线型双链 DNA 病毒，无包膜，呈二十面体，共有 93 个成员，分两个 属：哺乳动物腺病毒属和禽腺病毒属。目前已鉴定的人腺病毒有 6 个亚属，其中常用来构建载 体的腺病毒主要为 C 亚属的 2 型（Ad2）和 5 型病毒（Ad5）。腺病毒感染人体细胞时呈裂解型， 不会致癌；对啮齿目动物细胞来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌。 28. 腺病毒作为转化载体的特点（重点）腺病毒作为转化载体的特点（重点）：基因组重排率低，安全性能好，宿主范围广，重组病 毒的效价高，外源基因在载体上容易高效表达。缺陷：重组的外源基因不能持久表达，而且病 毒蛋白对体液和 T 淋巴细胞具有免疫原性。 29. 猴肿瘤病毒猴肿瘤病毒 SV40SV40 与腺病毒的差异（重点与腺病毒的差异（重点）：SV40 为双链环状 DNA 病毒，它衍生出的载体在使 用时受到许多限制：只能转染猴细胞，外源基因的装载量较小，而且基因组常常发生重排和缺 失的现象。 30. 反转录病毒特点反转录病毒特点：是一种整合型的单链 RNA 病毒，一般携带两个拷贝的单链 RNA 基因组， 其上包括 6 个区域，从 5端依此为：5长末端重复序列（5-LTR，含转录起始信号）；