牛奶中细菌牛奶中细菌 DNA 提取试剂盒提取试剂盒Norgen 生产的牛奶细菌 DNA 提取试剂盒的设计是为快速提取从牛奶中发现的多种细菌 DNA 基因组而准备的。这个试剂盒可供从牛奶样品中发现的革兰氏阴性和革兰氏阳性菌的 DNA 基因组。DNA 基因组是优先于其他蛋白细胞质中纯化得到的。DNA 基因组的标准产量依牛奶样品中细菌的密度和种类不同而不同。纯化的DNA 基因组可以被已检测到的限制酶完全消解，并且完全兼容PCR，可以用 PCR 定量和 Southern 印迹法分析。Norgen 的提纯技术的提纯技术纯化是使用 Norgen 所设计的树脂作为分离基质用旋转柱层层析法进行的。Norgen 树脂在高盐浓度下结合 DNA，在低盐和弱碱条件下释放已结合的 DNA。在牛奶样品中发现的细菌的 DNA 基因组的提纯过程中的第一步离心牛奶样品以凝集可能存在的细菌。如果DNA 是从革兰氏阳性菌或未知菌株中提取，那么凝集团块悬浮在酶切缓冲液中以供分解细菌细胞壁。下一步涉及到的溶解细菌细胞是与提供的裂解缓冲液和蛋白酶 K 结合，这适合各种细菌。在孵育 45分钟后，将结合液和酒精加到裂解物中，并将溶液卡到核酸纯化柱上。Norgen 树脂结合 DNA 的方式取决于离子浓度,因此,DNA 将结合到纯化柱上,而大部分的 RNA 和消化蛋白质会倒掉或留在树脂上部。结合 DNA 再用提供的清洗缓冲液清洗两遍以除去所有残留杂质，用洗脱缓冲液洗脱纯化的细菌 DNA 基因组。说明书说明书试剂盒说明书最大牛奶量 1ml10 个样本的纯化时间 1 小时可处理细菌种类 革兰阴性菌和格兰阳性菌最小可捡限量 每毫升牛奶 10 个细菌优点优点1.用快速核酸纯化柱快速又简便2.可提纯牛奶中发现的格兰阳性菌和革兰阴性菌中的 DNA 基因组3.可检测到并提纯牛奶样本中的极低浓度细菌（每毫升 10 个细菌）4.提纯高质量 DNA 基因组试剂盒组分试剂盒组分组成 每 25 个样酶切缓冲液3ml裂解液12ml结合液4ml洗液 115ml洗液 25ml洗脱缓冲液8ml蛋白 K（冻干）6mg溶菌素（粉）60mg小型核酸纯化柱25收集管251.7ml 的洗脱管25产品说明书1储存条件和产品的稳定性储存条件和产品的稳定性所有液体严密密封，在室温下保存。溶菌素在到达前保存在零下 20摄氏度，酶切缓冲液在添加溶菌素前保存在零下 20 摄氏度。冻干的蛋白 K 在到达前和复原后应该保存零下 20 摄氏度。这些试剂在未开封前可保质至少 1 年。预防措施和免责声明预防措施和免责声明这个试剂盒是专门为科研设计的，并不为人类和诊断使用。使用试剂时确保穿着合适的实验服、戴一次性手套、护目镜。有关更多信息，请参考合适的材料安全数据表（MSDSs)。这些可以在www.norgenbiotek.com 中看 PDF 文件。结合缓冲液和清洗液 1 中含有胍盐，使用时要小心。胍盐再与漂洗剂结合时形成高活性化合物，因此必须妥善处理这些试剂。提供试剂和设备提供试剂和设备微型离心管台式微量离心机微量移液枪550C 孵化箱370C 孵化箱（只为革兰阳性菌）溶葡球菌酶（只可选革兰阴性菌）96-100%的酒精棉签使用之前的准备使用之前的准备1.会用到一台可用最大量程的变速离心机。如果没有可变速离心机，可以用一台固定转速的离心机，不过可见产量下降。2.预热孵育箱或加热器到 550C（未知或格兰阳性菌热到 370C）3.给提供的清洗液II离心管中加入 15ml96-100%的乙醇。这部完了将是 20ml。瓶子上的标志以供检查是否加了乙醇。4.将蛋白酶 K 溶于 300L 分子水平级别的水，等分成小分，在零下20 摄氏度下保存这种没用过的蛋白知道使用时。5.将提供的酶切缓冲液加到含有溶菌酶的离心管中，混合均匀。等分成小分，在零下 20 摄氏度下保存这种没用过的蛋白直到使用时。6.已知革兰氏阳性菌抗溶菌素，比如葡萄球菌，就该补充含溶葡球菌素的酶切缓冲液（不提供） 。每管液体中，加 5 微升溶葡球菌素液到 100 微升的酶切缓冲液中（含溶菌素） 。7.如果只提革兰氏阴性菌，请用 1A 步骤；未知或革兰阳性菌，请用1B 步骤。1A1A1.将最多 1ml 的牛奶加到微型离心管中。注：最多 1 毫升的牛奶是推荐给正常的牛奶样品或亚临床乳腺炎样本。临床乳腺炎样本,尤其是那些高白细胞的样本,建议最多 200L牛奶样品。如果样品非常粘，非常难吸,用 18ml 规格的注射器细几次即可降低其粘度。2.14000g 离心 3 分钟3.快速倒立管倒掉上清，并在废液池壁轻轻磕几下以确保磕掉离心后牛奶样品上层飘的奶油。用干净的 200 微升的枪尖或棉签清除掉残留在微量离心管壁上的白色物质。确保白色颗粒没掉进去。4.加入 400 微升的裂解液和 10 微升重溶的蛋白酶 K，漩涡混匀。5.55 摄氏度下孵育溶解产物 45 分钟，间或漩涡混合溶解产物。1B1B1.将最多 1ml 的牛奶加到微型离心管中。注：最多 1 毫升的牛奶是推荐给正常的牛奶样品或亚临床乳腺炎样本。临床乳腺炎样本,尤其是那些高白细胞的样本,建议最多 200L牛奶样品。如果样品非常粘，非常难吸,用 18ml 规格的注射器细几次即可降低其粘度。2.14000g 离心 2 分钟3.快速倒立管倒掉上清，并在废液池壁轻轻磕几下以确保磕掉离心后牛奶样品上层飘的奶油。用干净的 200 微升的枪尖或棉签清除掉残留在微量离心管壁上的白色物质。确保白色颗粒没掉进去。4.将溶解物再悬于 100 微升的酶切缓冲液中。在 37 摄氏度孵育 45分钟，期间偶尔漩涡混匀。注：确保提供的溶菌酶加到了酶切缓冲液中。5.孵化后，加入 300 微升细胞裂解液和 10 微升重溶的蛋白酶 K 到酶溶混合物中，旋涡混合均匀。6.在 55 摄氏度下孵育 45 分钟，期间偶尔漩涡混匀。2 2 样品结合到滤膜上样品结合到滤膜上1.孵育后，加 40 微升结合液和 180 微升 96-100%乙醇到裂解混合物中，旋涡振荡。2.14000g 离心 10s。在水相上部产生一层薄薄的油脂。用吸管小心翼翼地将清澈的水相转移到连有收集管的3.14000g 离心 3 分钟以凝集细菌 DNA.注：如果液体没有全部通过滤网，14000g 再离心 2 分钟。如果还有少量液体留在滤膜上，继续下一步。3 3 洗滤膜洗滤膜1.加 500 微升清洗液I到滤膜上，14000g 离心两分钟2.倒掉洗液，重组滤网和集合管。3.加 500 微升清洗液II到滤膜上，再离心 2 分钟 注：确保清洗液 2中加入了适量的乙醇。4.倒掉洗液，重组滤网和集合管。离心 3 分钟以确保树脂完全干燥。5.丢掉集合管。4 4 洗脱洗脱 DNADNA1.转移过滤网到提供的 1.7ml 的洗脱管中2.加 200 微升的洗脱液到过滤网上，2600g 离心 2 分钟。注：若要高浓度 DNA，可以加 100 微升3.再 14000g 离心 2 分钟，以完全洗脱 DNA问题指导问题指导问题 原因解决方案样品太大牛奶样品太黏 过滤网阻塞白色奶油层在最初的 旋转后没有被移除白色奶油层在最初的 旋转后没有被移除在装入过滤 网前，溶菌 产物是胶状样品太大奶样中含有其他菌裂解细胞不完全DNA 基因组 含量太低DNA 洗脱不完全DNA 基因溶 解了不恰当的处理 DNA 基 因组