一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010 年 13 日-23 日实验室基础生物 2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1） 、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。（2） 、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。（3） 、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。（4） 、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。2、果胶酶的酶活测定方法（1） 、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。（2） 、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。（3） 、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。（4） 、还原糖法（DNS 法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与 3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在 540nm进行测定。3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1） 、培养基成分：C 源、N 源、无机盐、水和生长因子（2） 、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3） 、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度 、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一） 、培养基1、菌种筛选使用培养基（1） 、 基本培养基:果胶 1% 、磷酸氢二钠 0.5%、蛋白胨 1%、pH4.5、琼脂 2.0%。（2） 、分离培养基：果胶 0.5%、磷酸氢二钠 0.5%、琼脂 2.0%、H4.5。（3） 、发酵培养基果胶 1%、磷酸氢二钠 0.5%、蛋白胨 1%、pH4.5。2、黑曲霉 Asp-2 固体发酵培养基菌种斜面培养基（查氏培养基）：NaNO3 0.2%、K2HPO4 0.1%、KCl0.05%、MgSO4 0.05%、FeSO4 0.001% 、蔗糖 3%、琼脂2.5%、自然 pH。3、种子培养基：麸皮 3.0% 、橘子粉 2.0%、硫酸铵 0.5%、葡萄糖 1%、KH2PO4 0.1%、pH4.5。4、固体发酵培养基：麸皮 10g、橘子粉 2.5g、(NH4)SO4 0.1g（0.8%干料计） 、葡萄糖 0.125g（1%干料计） 、水 15ml。（2） 、试剂1、酶活测定使用试剂（1） 、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：称取柠檬酸 15.652g，柠檬酸钠 7.5g，溶解定容至 1000ml，用 0.1M NaOH 或 0.1M HCl 调节 pH 至 3.0。（2） 、底物0.25%果胶溶液：称取 0.25g 果胶，用上述缓冲液溶解，在电炉上加热至完全溶解，用缓冲液定容至 100mL，储存于 4，7 天内有效。 （3） 、DNS 试剂：称取酒石酸钾钠 182.0g、溶解于 500 mL 水中，加热（不超过50） ，于热溶液中依次加入 3-5 二硝基水杨酸 6.3g，氢氧化钠 21.0g，苯酚5.0g，无水硫酸钠 5.0g，搅拌均匀至溶解，冷却后定容至 1000 mL，储存于棕色瓶中，室温保存，710 天后过滤使用。 （三） 、仪器（1） 、烧杯、三角瓶、试管、移液管、洗耳球、量筒、容量瓶、试剂瓶、研钵等；（2） 、天平、灭菌锅、超净工作台、培养箱、电炉、恒温水浴锅、记时器（精确到秒） 、分光光度计等。四、实验方法步骤（一） 、果胶酶产生菌的分离稀释涂布平板法1、菌种的采集要获得产生果胶酶的菌种，可从富含果胶酶作用底物的场所去采集。胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛果胶酶时，只要到相应的环境中采样即可。 （果树下面的土壤里）2、倒平板配制分离培养基 高压灭菌 30min 冷却至约 50 倒 56 块平板/100mL 冷却备用3、制备土壤稀释液（1）称取土样 10g，放入 90mL 无菌水中（带玻璃珠） ，摇动 10min，静置10min,制备得到 10-1 土壤稀释液；（2）用无菌吸管吸出 1mL 土壤悬液，加入盛有 9mL 无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到 10-2 土壤稀释液；（3）再从中吸出 1mL 加入盛有 9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到 10-3 土壤稀释液；（4）以此类推，分别制备得到 10-4、10-5、10-6、10-7 土壤稀释液。4、 、涂布用无菌吸管分别吸取 10-3、10-4、10-5 、10-6 和 10-7 土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。5、富集培养采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。培养时控制培养的温度、pH 和营养成分等。6、菌种的分离培养基里含有果胶，能利用该底物生长的菌种就是所需要的产果胶酶菌种。7、纯化挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37倒置培养 23d；如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养。（二） 、果胶酶产生菌的发酵1、配置发酵培养基 40mL/瓶。2、分别挑取细菌和霉菌菌落接种于发酵培养基中。3、37、 200r/min 摇瓶发酵约 72h。（三） 、果胶酶的活性测定（1） 、待测酶液的制备将发酵液离心，取上清液用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液稀释 10 倍（2） 、制作标准曲线半乳糖醛酸溶液（ml）0.00.20.40.60.81.01.2半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2缓冲液（ml）2.01.81.61.41.21.00.8DNS (ml)3333333定容总体积(ml)20202020202020OD（540nm）（3） 、酶活的测定操作步骤空白管样品管 A样品管 B步骤 1吸取 1.8mL 果胶底物溶液吸取 1.8mL 果胶底物溶液吸取 1.8mL 果胶底物溶液步骤 237保温 5 分钟37保温 5 分钟37保温 5 分钟步骤 3加入待测酶液0.2ml加入待测酶液0.2ml步骤 437精确保温30min37精确保温30min37精确保温30min步骤 5加入 3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止反应加入 3mLDNS 试剂终止反应步骤 6混合均匀混合均匀混合均匀步骤 7加入 0.2ml 待测酶液，沸水浴煮沸5min沸水浴煮沸 5min沸水浴煮沸 5min步骤 8流水冷却流水冷却流水冷却步骤 9加蒸馏水 15mL 混匀加蒸馏水 15mL 混匀加蒸馏水 15mL 混匀步骤 10OD540nm 比色OD540nm 比色OD540nm 比色二、实验报告（一） 、实验结果及现象1、标准曲线半乳糖醛酸（mg）0.00.20.40.60.81.01.2OD 值（540nm）0.0000.0850.2410.4050.5500.7030.8502、酶活测定值菌种类型细菌霉菌0.0830.0870.0070.007OD 值（540nm）0.0830.1030.0020.002平均 OD 值0.0890.0045酶活计算(细菌)(1.3623*OD+0.0484）*N*1000 酶活 E= = 6.159umol/ml 0.2*194.14*10 （2） 、实验总结和分析1、注意事项（1） 、接种时的注意事项接种方式是液体固体，用灭菌的移液管或 10ml 量筒接种或大枪头；接种后振荡接种瓶，使菌种充分与固体培养基混合。（2） 、酶活测定注意事项试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS 时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头；精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；（3） 、UV2000 型分光光度计的使用注意事项提前半小时接通电源，打开机器开关使仪器通电，自检；将对照液及测定液分别装入比色杯 3/4 体积并用镜头纸擦干外壁，放入样品室；调节测定所用波长；读数完毕，打开仪器盖板，关闭开关，将比色杯冲洗干净、浸泡于 30酒精中。2、实验总结实验菌种的采集不成功，没有到要求的地方采集，也可能是温度较低不适宜菌体生长；菌种分离纯化时可能是无菌操作不严格，导致平板上面杂菌滋生，没有分离出目的菌种，各方面的操作都有不严谨之处，最后得到的酶活性较低，实验做的不是很成功。3、参考文献【1】 、陈守文主编.酶工程.北京：科学出版社，2008【2】 、沈萍.范秀容.李广武 微生物学实验 2000 【3】 、于龙江主编.发酵工程原理与技术应用.北京：化学工业出版社，2006.6【4】 、田国政 酒曲根霉糖化性质的研究 期刊论文 -湖北民族学院学报（自然科学版）2003(02) 【5】 、刘建军.姜鲁燕 根霉 PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究 1998(02) 【6】 、全国食品发酵标准化中心等单位编制.工业用酶制剂行业标准资料汇编.M.1993:37 44。【7】 、沈萍.范秀容.李广武 微生物学实验 2000 【8】 、刘建军.姜鲁燕 根霉 PE-8菌株的选育及其淀粉降解酶类的研究 1998(02) 【9】 、孙君社.酶与酶工程及其应用.北京.化学工业出版社.20064、教师评语及评分签名： 年 月 日