1冈田酸诱导 SH作者：刘荣芳, 许文芳, 许盈, 俞昌喜 【关键词】 肿瘤抑制蛋白质类;,岗田酸;,tau 蛋白质类;,磷酸化;,细胞系;,阿尔茨海默病摘要: 目的 研究冈田酸(OA)诱导 SHSY5Y 细胞后 tau 蛋白磷酸化程度和PTEN 蛋白水平的变化。方法 40 nmol/L OA 孵育 SHSY5Y 细胞不同时间(0,3,6,12,18,24,36,48 h)后,倒置显微镜观察细胞的形态变化,免疫印迹检测各时间点 tau 蛋白 ser396 位点的磷酸化及 PTEN 蛋白水平的变化。结果 SHSY5Y 细胞随 OA 孵育时间的延长逐渐出现细胞胞体变圆,突起回缩,悬浮生长至死亡。细胞tau 蛋白 ser396 位点磷酸化水平于 OA 作用 3 h 开始升高,18 h 达高峰,随后逐渐下降,48 h 低于基础水平;而 PTEN 蛋白水平于 OA 作用 3 h 开始升高,6 h 达高峰,之后逐渐下降,18 h 开始低于基础水平。结论 OA 诱导 SHSY5Y 细胞后 tau 蛋白磷酸化水平和 PTEN 蛋白水平均呈先上升后降低的变化趋势。关键词: 肿瘤抑制蛋白质类; 岗田酸; tau 蛋白质类; 磷酸化; 细胞系; 阿尔茨海默病ABSTRACT: Objective To study the change of PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10) protein in the okadaic acid(OA) induced of tau protein hyperphosphorylation in SHSY5Y cells. Methods SHSY5Y cells were treated with 40 nmol/L OA for 0, 3, 6, 12, 18, 24, 36, 48 h, and then observed by inverted microscope. Western Blotting was used to detect the levels of phosphorylated tau protein at site Ser396 and the change of PTEN in SHSY5Y cells. Results Cells changed gradually after treated with 40 nmol/L OA and appeared typical morphology of Alzheimers disease(AD). The levels of phosphorylated tau at site Ser396 was increased after exposure of 3 h and reached the maximum level after 18 h, then declined to the level below normal after 48 h.The levels of PTEN was increased after exposure of 3 h and reached the maximum level after 6 h, then decreased to the level 2below normal after 18 h. Conclusion In the OA induced of tau protein hyperphosphorylation in SHSY5Y cells, the levels of PTEN protein, showing a trend of dramatic increase and then decrease also.KEY WORDS: tumor suppressor proteins; okadaic acid; tau proteins; phosphorylation; cell line; Alzhermers disease阿尔茨海默病(AD)是一种慢性、进行性神经变性疾病。AD 的病因和发病机制尚未完全阐明,目前普遍认为 tau 蛋白的过度磷酸化在促进 AD 患者神经细胞退行性变性中起着关键作用。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10)是一种抑癌基因表达的蛋白,是细胞信号转导的重要调控分子,可负调控 PI3K/Akt 介导的信号转导通路1。PTEN 在神经系统中的作用正日益受到关注23,但其在 AD 发生发展中的作用尚不明了。有报道,通过抑制 PI3K/Akt 通路可促进 AD 病变,而激活 PI3K/Akt 通路则有对抗 淀粉样蛋白致 AD 样作用45。PTEN 通过降低 PIP3 水平,拮抗了 PI3K/Akt 活性1,因此推测 PTEN 在 AD 发生发展中可能存在变化。新近有报道,AD 患者尸体脑内 PTEN 表达减弱或缺失67,这与上述相关研究和推测不相吻合。笔者采用冈田酸(okadaic acid,OA)诱导SHSY5Y 细胞为 AD 样细胞研究模型,观察实验性 AD 发生发展过程中 SHSY5Y细胞形态、tau 蛋白磷酸化及 PTEN 蛋白水平的动态变化。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 细胞株 人神经母细胞瘤细胞 SHSY5Y(中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所)。1.1.2 试剂 3OA(美国 Sigma 公司);DMEM/F12 培养液(美国 Gibco 公司);actin 多克隆抗体、taupS396多克隆抗体、PTEN 单克隆抗体、Western Blot 化学发光检测试剂盒(美国 Santa Cruze 公司)。1.1.3 主要仪器 CO2 培养箱(美国 Forma Scientific 公司);倒置显微镜(CK40 型,日本 Olympus公司)。1.2 方法1.2.1 细胞培养 SHSY5Y 细胞用含 10%胎牛血清的 DMEM/F12 培养液于 37 、体积分数为0.05 的 CO2 培养箱中培养,用 0.25胰蛋白酶消化单层培养细胞,待细胞间隙变得比较明显、细胞突起有所回收时中止消化,DMEM/F12 培养液吹打成单个细胞悬浮液,隔 34 d 传代 1 次。1.2.2 分组 未加 OA 的 SHSY5Y 细胞(0,3,6,12,18,24,36,48 h)为对照组，OA(40 nmol/L)作用 SHSY5Y 细胞(0,3,6,12,18,24,36,48 h)为模型组。1.2.3 细胞形态观察 SHSY5Y 细胞经过处理后,倒置显微镜下观察细胞形态。1.2.4 蛋白免疫印迹 SHSY5Y 细胞经过处理后,弃培养液,用预冷的 PBS 清洗 2 次,加入细胞裂解液4在冰面上裂解 20 min,用小刮匙刮下细胞,置于 Appendorf 管中,12000 r/min、4 离心 10 min,吸取上清。Bradford 法进行蛋白定量。10%SDSPAGE 电泳(浓缩胶:恒压80 V,电泳约 30 min;分离胶:恒压 120 V,约 1 h),用湿式转移法转至 NC 膜,用含 5%脱脂奶粉的 TBST 4 封闭过夜。加入用 TBST 稀释的 PTEN 单克隆抗体(11000稀释),室温孵育 6 h。TBST 漂洗后加入抗鼠二抗(12000 稀释),室温孵育 1 h。化学发光显色,X 射线胶片曝光。抗体洗脱液洗脱抗体(50 ,30 min)。继续用含 5%脱脂奶粉的 TBST 4 封闭过夜。加 taupS396多克隆抗体(11000 稀释),室温孵育 6 h,TBST 漂洗后加入抗兔二抗(14000 稀释),室温孵育 1 h。化学发光显色,X 射线胶片曝光。以 actin 作为内参照,实验重复 4 次。1.2.5 半定量分析 采用条带密度分析法,将模型组各时间点蛋白条带密度值除以对应的 actin 蛋白条带密度值,获各蛋白条带相对密度值,该值除以相应的 0 h 值,获各自的蛋白相对量。1.3 统计学处理 测定值以 xs 表示,采用 SPSS 10.0 统计分析软件包分析。 2 结果2.1 OA 对 SHSY5Y 细胞形态的影响 OA 未孵育时(0 h)细胞铺展良好,突起多而粗大,胞体呈多角形或不规则形。OA孵育 6 h 后,少量细胞胞体开始变圆,突起回缩;18 h 后,大部分细胞胞体变圆,突起回缩甚至消失;48 h 后,多数细胞呈悬浮生长,胞体变圆,突起消失,部分细胞死亡(图1)。随 OA 孵育时间增加,SHSY5Y 细胞呈进行性损伤变性。52.2 OA 对 SHSY5Y 细胞 tau 蛋白磷酸化的影响 对照组 Ser396 位点磷酸化 tau 蛋白水平在观测时间点未见变化,模型组 Ser396位点磷酸化 tau 蛋白水平与所得比值见图 2。40 nmol/L OA 作用于细胞,Ser396 位点磷酸化 tau 蛋白在 3 h 开始升高,18 h 达高峰,之后下降,48 h 低于基础水平,actin蛋白水平保持不变。OA 可诱导 SHSY5Y 细胞后 tau 蛋白磷酸化程度先升高后降低。2.3 PTEN 蛋白水平在 OA 诱导 SHSY5Y 细胞 tau 蛋白过度磷酸化中的变化 对照组 PTEN 蛋白和 Ser396 位点磷酸化 tau 蛋白在观测时间点未见变化;模型组 PTEN 和 Ser396 位点磷酸化 tau 蛋白的变化及所得比值见图 2。40 nmol/L OA孵育细胞,Ser396 位点磷酸化 tau 蛋白在 3 h 开始升高,18 h 达高峰,之后下降,48 h低于基础水平;而 PTEN 蛋白于 3 h 开始升高,6 h 达高峰,之后下降,18 h 后低于基础水平。在 OA 诱导 SHSY5Y 细胞过程中,PTEN 蛋白水平存在着变化,呈急剧上升随后降低的趋势。3 讨论3.1 AD 样细胞研究模型的选择 OA 是一种蛋白磷酸酶抑制剂,可抑制磷酸酶的活性,使 tau 蛋白高度磷酸化8。SHSY5Y 细胞具有神经元的形态特点,且 tau 蛋白含量较高,调节 tau 蛋白磷酸化的蛋白激酶和蛋白磷酸酶的含量也较高9。体内外实验表明,OA 能诱导 tau 蛋白发生磷酸化,可用于建立研究 AD 的细胞模型1012。笔者采用 40 nmol/L OA 作用于 SHSY5Y 细胞可引起细胞形态的改变,并可诱导 tau 蛋白磷酸化,与文献报道相6吻合10,13。3.2 AD 样细胞研究模型的发生发展 为便于分析 AD 发生发展中 PTEN 蛋白水平的变化,根据细胞形态及磷酸化tau 蛋白的改变,笔者试将 OA 诱导的 AD 样发生发展过程进行分期。OA 处理SHSY5Y 细胞 6 h 形态未见明显改变,但磷酸化 tau 蛋白于 3 h 开始升高,6 h 进一步升高,试将此 6 h 时间点作为反映本实验性 AD 诱导期;OA 处理 SHSY5Y 细胞18 h 形态明显改变,且磷酸化 tau 蛋白达高峰,此时间点作为反映实验性 AD 形成期;OA 处理 SHSY5Y 细胞 48 h 出现明显死亡现象,此时间点反映实验性 AD 终末期。3.3 AD 样细胞研究模型发生发展中 PTEN 的变化及其可能机制 PTEN 可特异性裂解 PI3K 的产物 PtdIns(3,4,5)P3 的 D3 磷酸基,使其转变成PIP2,从而降低 PIP3 的水平,对抗 PI3K 的作用1。PIP3 水平的升高可激活丝/苏氨酸激酶 Akt,而 GSK3 是 Akt 重要的效应分子。Akt 可磷酸化 GSK3Ser9,从而抑制其活性。GSK3 则是引起 tau 蛋白磷酸化重要的蛋白激酶。由此可见,tau 蛋白的磷酸化与 PI3K