ICS 11.220B42DB45广西壮族自治区 地方标准DB 45/T XXXXX2011猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚 合酶链反应法（RT-PCR）点击此处添加标准英文译名点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（征求意见稿）（本稿完成日期：2010 年 12 月）2011 - XX - XX 发布2011 - XX - XX 实施广西壮族自治区质量技术监督局 发 布DB45/T XXXXX2011I目 次前言.II1 范围.12 术语和定义.13 材料准备.13.1 用于猪 EMCV 检测的特异性引物.1 3.2 试剂.2 3.3 仪器设备及耗材.34 操作方法.34.1 待检样品处理.3 4.2 待检样品总 RNA 提取.3 4.3 RT-PCR 检测 .4 4.4 注意事项.45 PCR 检测结果判定 .55.1 电泳.5 5.2 结果判定.5附录 A（规范性附录） 引物序列及检测结果判定 .6附录 B（规范性附录） 溶液的配制 .7附录 C（规范性附录） 溴化乙锭的净化处理 .8附录 D（资料性附录） 本标准词汇英汉对照表 .10DB45/T XXXXX2011II前 言聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种核酸体外扩增技术，应用该技术对 猪脑心肌炎病毒进行快速鉴别检测具有重大意义。本技术规程在充分参考文献资料、经过实验室和生 产应用验证的基础上制订的，适用于猪脑心肌炎病毒的检测。 请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。 本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。 本标准主要起草人：施开创、郑敏、莫胜兰、胡杰、屈素洁、李军、刘棋。 本标准为首次发布。DB45/T XXXXX20111猪脑心肌病毒（EMCV）的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）1 范围本标准规定了猪脑心肌炎病毒（EMCV）检测的材料准备、操作方法及结果判定。 本标准适用于猪脑心肌炎病毒的检测。2 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1 脑心肌炎病毒 encephalomyocarditis virus（EMCV）脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus,EMCV)属于微RNA病毒科心病毒属的成员，其核酸为 单股正链RNA，基因组核苷酸长度大约7.8 kb。EMCV可以引起某些哺乳动物、乃至灵长类动物以脑炎、 心肌炎或心肌周围炎为主要临床特征的急性传染病。EMCV在猪主要以断奶仔猪的急性心肌炎、突然死 亡以及母猪的繁殖障碍为特征。临床上仔猪表现为突然死亡、心肌变性、出血、呼吸困难，而母猪常 无明显的临床症状或表现出严重的繁殖障碍。病猪的心脏、扁桃体、胰腺、脾脏、肠道及肠系膜淋巴 结等均有肉眼可见的病变，其中以心内膜、心外膜和心室乳突上的灰白色条状或圆形坏死灶为其主要 特征。2.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction（PCR）PCR 技术是一种在体外快速扩增特定 DNA 片段的方法。由热变性复性延伸三步反应组成一个 PCR 循环，经过多次循环反应，使目的 DNA 得以大量扩增。2.3 反转录 reverse transcription以RNA为模板合成cDNA的过程。2.4 引物 primer与待扩增DNA片段两侧互补的一小段寡核苷酸。3 材料准备3.1 用于猪 EMCV 检测的特异性引物DB45/T XXXXX20112参考GenBank上猪源EMCV BJC3毒株（GenBank登录号：DQ464062）的3D序列，选择保守区域设计并 合成一对引物。引物序列见附录A.1.1。该引物可以特异性扩增病毒的3D基因，扩增片段长度为286 bp。3.2 试剂3.2.1 猪 EMCV 特异性引物上、下游引物的使用浓度均为25 pmol/L。3.2.2 RNA 抽提试剂盒使用宝生物工程（大连）有限公司生产的Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0试 剂盒1)。试剂盒包含了提取RNA所需的除1 %冰乙酸异丙醇以外的全部试剂： Solution A； Solution B； Rinse A； Rinse B； Spin column； Elution Buffer。3.2.3 RT-PCR 试剂盒使用天根生化科技（北京）有限公司生产的Quant 一步法 RT-PCR 试剂盒2)。该试剂盒包含RT- PCR一步法反应所需的全部试剂： 10 RT-PCR Buffer； 5 RT Enhancer Buffer； dNTP Mixture（10 Mm each）：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP； Rnasin（40 U/L）； Hotmaster Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)； Quant RTase（for one step）。3.2.4 DNA 分子量标准使用宝生物工程（大连）有限公司生产的DL2,000 DNA Marker3)试剂。3.2.5 电泳试剂电泳试剂如下: 1 琼脂糖； 10 mg/mL溴化乙锭（EB）；1）Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0 试剂盒是由宝生物工程（大连）有限公司提供的产品的商 品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 2）Quant 一步法 RT-PCR 试剂盒是由天根生化科技（北京）有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了 方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 3）分子量标准 DL2,000 DNA Marker 是由宝生物工程（大连）有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是 为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产 品。DB45/T XXXXX20113凝胶加样缓冲液； 1倍Tris-硼酸电泳缓冲液。3.2.6 其他试剂其他试剂如下： 灭菌双蒸水； 1 mol/L灭菌PBS，pH7.2； DEPC H2O。注：各种试剂的配制方法见附录B。3.3 仪器设备及耗材3.3.1 仪器设备本方法使用下列仪器设备： PCR仪； 电泳仪； 紫外线检测仪； 凝胶成像系统； 高速台式冷冻离心机（离心速度12 000 r/min以上）； 小型高速离心机； 水浴锅； 旋涡振荡器； 乳钵或玻璃研磨器； 微量加样器：100 L1 000 L、20 L200 L、10 L100 L、 5 L50 L、0.5 L10 L和0.1 L2.5 L等多种规格。3.3.2 一次性耗材本方法使用下列一次性耗材： 乳胶手套； 离心管：2 mL、1.5 mL和0.5 mL； PCR反应管； 吸头：100 L1 000 L、20 L200 L、5 L40 L、0.1 L10 L等多种规格。4 操作方法4.1 待检样品处理无菌采取待检猪的心脏、脾脏、脑组织和淋巴结等各约2克，置于乳钵或玻璃研磨器中，充分研磨 后，加入16 mL无菌PBS；收集组织悬液反复冻融3次后，以3 000 r/min离心5 min，收集上清液，供总 RNA提取用，或者置-70 保存备用。4.2 待检样品总 RNA 提取取经处理的待检样品上清200 L置于无RNA酶的1.5 mL离心管中，加入200 L Solution A，剧烈 震荡混匀，室温放置5 min；加入75 L Solution B，轻柔混匀后，12 000 r/min 4 离心5 min。DB45/T XXXXX20114取上清液转移至新的1.5 mL离心管中，加入250 L含1 %冰乙酸的异丙醇，混匀。将Spin column安置 于2 mL的离心管中。将混合液转移至Spin column 中，12 000 r/min 4 离心1 min，弃滤液。将500 L的Rinse A加入到Spin column中，12 000 r/min 4 离心1 min，弃滤液。再将500 L的Rinse B 加入到Spin column中，12 000 r/min 4 离心1 min，弃滤液。重复用Rinse B再洗涤一次。将Spin column安置于新的1.5 mL的离心管上，在Spin column膜的中央处加入30 L的Elution Buffer，室温 静置1 min。12 000 r/min 4 离心1 min，收