实验五制备大蒜 SOD 实验申请实验题目： 实验原理 : 利用丙酮沉淀法，从大蒜汁中分离提取SOD 实验原料：新鲜蒜瓣约 20g 实验仪器：离心机 超声波细胞破碎 分光光度计辅助仪器：电子天平、圆底烧瓶、烧杯、玻璃棒、真空泵、分液漏斗、研 钵等实验试剂：50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5)缓冲液、氯仿、乙 醇、预冷丙 酮、活性测定缓冲液参考书目：1 李永利 , 张众 . 邻苯三酚自氧化法测定活性 J.中国卫生检验 2000,12,10(6):673 2 孙永君 . 大蒜中 SOD 的提取研究 J.化学与生物工程.2005,(10):2325 3 邹芝芳 , 刘佳佳 . 三种大蒜中提取SOD 的对比研究 J.食品科学 2004,34(5) 4 张丽 , 罗丽萍 , 谷力 . 大蒜 SOD 的分离纯化及其低温胁迫下的酶活性J.吉首大学学 报 .2003,24(4) qtw-1 实验记录操作记录：制备大蒜 SOD 操作说明及结果记录：校正天平后，取新鲜蒜瓣 20g 可以数组合并进行。组织捣碎机处理10min。 合并破碎者，需要先分开，再进行相关操作。 加入 50mM NaPi buffer ( pH7.8) (91.5+8.5) 150ml 磷酸缓冲液，搅拌均匀。 超声破碎 (5s+10s)40 times (冰水浴 ) 搅拌浸提10min先用纱布过滤，再用漏斗过滤，得滤液 60 热变性 20min过滤或离心去除沉淀，得上清液，测体积V1。 另取适量体积的(20ml) 滤液，加 2 倍体积的 氯仿 -乙醇 (3 ：5) ，于分液漏斗中振荡5min。 分离上层水相，加入等体积的预冷丙酮。 搅拌 15 分钟，使沉淀完全。4000rpm,15min 离心，收集沉淀 注意先称离心管质量将沉淀称重，得产品，计算收率。 部分沉淀用活性测定缓冲液溶解，用于 SOD 活性检测，计算总的酶活与得率。qtw-2 实验结果与分析数据整理 ：1、空离心管质量：第组 4.131g 第组 4.056g 粗体物与容器质量：第组 4.265g 第组 4.223g 产品质量：第组 4.265-4.131=0.134g 第组 4.223-4.056=0.167g 2、冰丙酮沉淀SOD qtw-3 冰丙酮加入溶液中后出现大量白色絮状沉淀，在10000rpm 下高速离心出现淡黄色沉淀。3、邻苯三酚自氧化抑制标准曲线制作邻苯三酚自氧化速率测定表1：试剂测量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L 4.5 4.5 ddH2O 2.2 2.5 PH8.7磷酸缓冲溶液2.0 2.0 邻苯三酚 3mmol/L(用 10mmol/L HCl 配 制) 0.3 0.0 酶活力测定表2：试剂测量管空白管Tris-HCl PH8.0 100mmol/L 4.5 4.5 ddH2O 2.2 2.5 酶溶液2.0 0.0 PH8.7 磷酸缓冲溶液0.0 2.0 邻苯三酚 3mmol/L(用 10mmol/L HCl 配 制) 0.3 0.0 吸光度测定数据：浸提温度条件：室温时间吸光度 邻苯三酚自氧化酶活抑制邻苯三酚自氧化 0.0 0.066 0.069 0.5 0.084 0.081 1.0 0.098 0.092 1.5 0.105 0.100 2.0 0.115 0.111 2.5 0.122 0.119 3.0 0.128 0.128 3.5 0.135 0.134 4.0 0.142 0.140 4.5 0.144 0.149 5.0 0.149 0.152 qtw-4 由于 0-3s 之间的吸光值与时间基本符合线性关系，所以去0-3s 间数据做曲线得：邻苯三酚自氧化抑制标准曲线y = 0.0199x + 0.0727R2 = 0.9627y = 0.0194x + 0.0709R2 = 0.99630.0000.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.1000.1100.1200.1300.1400.1500.1600.1700.1800.1900.2000.01.02.03.0 时间/minOD 值邻苯三酚自氧化标准曲线方程：0727.00199.0xyR2=0.9627 酶活抑制邻苯三酚自氧化方程：0709.00194.0xyR2=0.9963邻苯三酚自氧化速率A0=0.0199 加入 SOD后邻苯三酚自氧化速率A=0.0194 稀释倍数样品体积反应体积）活性（ %50%100/)(/00AAAmlSODml/31.115029%50%1000199.0/)0194.00199.0(数据分析：从标准曲线上可以看出加入SOD 的吸光度直线斜率略小于未计入酶溶液之前，说明 SOD 对邻苯三酚自氧化现象有抑制作用。但从实验结果分析，抑制作用不明显，直线斜率改变不大。也反映出分离提取的SOD 纯度不高，提取效率较低，分析有以下几点原因：1、 在浸提步骤中，前两组采用60水浴浸提，浸提效率较高，抑制效果较为明显；本组实验采用室温条件下浸提，浸提时间较短，浸提不够充分，提取效率qtw-5 较低，抑制效果不明显，与前两组形成明显差异。也说明60下水浴浸提为更为优化的SOD 提取工艺。2、 邻苯三酚自氧化试剂的自氧化速率较快，不易保存。所以实验所用的该试剂应现用现配，以保证试剂纯度。二本实验中的邻苯三酚试剂配制时间较长，部分试剂已完成自氧化过程，试剂纯度低，活性差，对实验结果造成一些影响。3、 本实验操作中采用超声波破碎技术，但是试验中超声波破碎仪的破碎效果不明显，对实验结果造成一些影响。操作总结：1、无论是手动搅拌还是机械搅拌，注意搅拌速度的控制。搅拌过快，过于剧烈，会使部分蛋白变性，影响SOD 的得率值。2、SOD 是一种热稳定性很好的酶。当温度低于80时，短时间的热处理酶活力不会有明显的变化，而一般杂蛋白却在高于55时就易变性沉淀，因此对大蒜抽提液进行短时间的热处理以达到去除杂蛋白的目的。3、邻苯三酚试剂要在最后加入，并立即进行比色。若耽搁时间过长，试剂显色程度会发生变化，表现在吸光值上就是测定不准。4、用丙酮沉淀法可以很方便地从大蒜汁中分离制得粗品SOD,能把大部分杂蛋白如粘多糖去除 , 但这种方法的缺陷就是要使用大量的有机溶媒, 难以规模化制备。原理总结：1、概述超氧化物歧化酶（SOD）是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子（O 2-）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8 磷酸缓冲液qtw-6 提取出。由于SOD 不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。植物叶片在衰老过程中发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低及内源激素平衡失调等。这些指标在一定程度上反映衰老过程的变化。近来大量研究表明，植物在逆境胁迫或衰老过程中，细胞内自由基代谢平衡被破坏而有利于自由基的产生。过剩自由基的毒害之一是引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化, 释放出 O2-, 生成带色的中间产物, 在325nm 有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min 这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。颜色深 SOD 逐渐增多颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。2、SOD 催化反应机理SOD 的耐热性较强，在65 以下温度对酶活影响很小，但温度一旦高于70 ，酶活力则下降很快。提取植物SOD 的最适宜温度为5565 ，最适宜的热变性时间为15 min。大部分蛋白质的变性温度为55 ，可以利用 SOD 和杂蛋白变性温度的差异进行热变性实现初 SOD 是一种广泛存在于生物体内, 能催化超氧负离子发生歧化反应的金属酶类。由于该酶能有效清除机体内超氧自由基, 从而有效地预防活性氧对生物品的毒害作用 , 因而具有抗辐射、抗肿瘤及延缓机体衰老等功能, 在保健品、医药和化妆品行业中有重要的应用价值。研究表明, 外源 SOD 具有保护 DNA 、蛋白质和细胞膜的作用, 使其免遭超氧负离子的破坏, 对辐射有防护作用。步分离，且不引入杂质。SOD是含金属辅基的酶。高等植物含有两种类型的SOD：Mn SOD和Cu.ZnSOD，它们可催化下列反应：大蒜 SOD 的价值qtw-7 大蒜所含化学成分十分复杂, 含有挥发油、多种氨基酸、维生素、糖及丰富的蛋白质 , 并含有多种矿物质及微量元素。研究证明大蒜具有卓越的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血脂、提高机体免疫功能、降血糖、解毒等功效。近年来将大蒜用于农、林、牧、渔方面防治病虫害和提高产量的研究也有很大进展。大蒜被美国时代专刊推荐为现代人十大最健康的食品之一。我国是世界大蒜种植的第一大国, 产量和出口量均居世界前列。因此研究开发利用大蒜资源具有重要意义。目前我国传统工业大多从动物的血液和内脏器官中提取SOD ，但这类原料来源有限，成分复杂，且在储存、运输等方面存在诸多不便，因此容易导致生产工艺复杂化，使生产成本大幅度上升。近来的研究发现，大蒜细胞中含有丰富的Cu、Zn-SOD ，其分子量约为 32000，与从牛血等动物血红蛋白中所提取的SOD 十分接近， , 用大蒜提取可使生产成本显著降低, 而且生产工艺也能得到很大简化, 这对于扩大生产规模、实现SOD 的广泛应用十分有利，而且其它各项性能也来源丰富、易于处理而使生产成本大大降低，而且生产工艺也能得到很大的简化，这对于扩大生产规模，实现SOD 的广泛应用将是十分有益的。实验问题：1、为什么要从植物中提取SOD？初步验证阶段。国外SOD 主要应用于医疗、保健方面，有以动物血液及内脏为原料制取 SOD 的报导，但存在着成本高、含有致热因子等缺陷，因此，适用范围极为有限。尤其是近年来受“疯牛病”的影响，许多国家和地区抵制以动物血液及内脏为原料制取的超氧化物歧化酶，使得超氧化物歧化酶在国际市场上极为紧缺。从植物，特别是人们日常经常食用的蔬菜、瓜果、野生植物及粮食中提取SOD，使用安全性非常高，避免了可能发生的交叉感染。利用全新的生物技术从植物中提取SOD，具qtw-8 有明显的社会和经济效益，市场前景广阔。从植物中提取SOD 的主要工艺流程为:植物打浆超滤分离有机溶剂去杂柱层析精制超滤浓缩冷冻干燥产品2、用 Tric-HCl 而不用磷酸缓冲液的原因因为反应物连苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能自氧化。而SOD 活力的测定是依靠SOD 抑制连苯三酚的自氧化实现的。磷酸缓冲液pH 大约为 7 点多，无法提供连苯三酚自氧化需要的碱性环境。3、邻苯三酚加入量对测量的影响邻苯三酚的浓度是决定其自氧化速率高低的一个主要因素，浓度越高，自氧化速度越快，相同单位的SOD 对邻苯三酚自氧化的抑制程度就越小，从而使得测量结果越低。所以为使结果具有可重复性，必须严格控制测定液中邻苯三酚的终浓度保持相同。qtw-9 实验补充材料一、（一般）酶的分离纯化方法：提取原则a. 相似相溶。 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质 易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。 酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合 或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。b. 远离等电点的pH 值，溶解度增加。酶的提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.020.5mol/L 的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH26 的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且