1 实验四细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名, 查看学生出勤情况。总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。二、板书部分（一）目的要求1. 掌握需氧菌分离培养的基本要领。2. 了解厌氧菌的分离培养原则及方法。（二）实验内容1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养。2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。3. 用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。4. 用划线法进行真菌的分离培养（示教）（三）作业1. 为什么要进行细菌的分离培养？2. 进行分离培养应注意哪些事项？3. 细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4. 叙述真菌的划线分离方法。三、实验内容主要内容有分离培养及目的、 注意事项、分离培养的方法、 真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。1. 什么是分离培养及目的： 分离培养是细菌学检验的基本技术之一。分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。2. 注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长， 要加血清或血液。 大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必2 须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰； 操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。3. 分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。方法左手拿琼脂平板， 使其与水平面成 45。角；右手拿铂金耳， 使之与水平面平行，靠近酒精灯火焰操作。 将接种环于酒精灯火焰中灼烧灭菌，待其冷却后， 蘸取欲检材料少许， 注意不要划破琼脂， 不要划得太疏， 以免造成浪费， 不要重复划线，以免形成菌苔。划线方法：方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线，选择其中一种进行划线。 划毕，将接种环烧灼灭菌， 于皿底用蜡笔标记被检材料名称及日期，倒转置恒温箱中培养。思考题：方格划线哪个地方会长出单个菌落比较多？（2）倾注法：不常用，这里不做介绍2）厌氧菌的分离培养方法厌氧菌生长繁殖的环境不能有游离氧的存在。故在培养厌氧菌时， 必须创造一个厌氧环境， 一般以降低氧的张力或保持减低的氧张力为原则。目前应用于厌氧菌的分离方法颇多，现就其中较简便且常用的几种方法介绍如下：（1）焦性没食子酸法利用焦性没食子酸在碱性溶液内能大量地吸收氧的原理进行厌氧培养。 通常 100cm3空间用焦性没食子酸1g，10% 氢氧化钠或氢氧化钾 10ml。具体方法有下列有平板培养法、干燥器培养法。平板培养法是将厌氧菌划线接种于适宜的琼脂平板，取一小团直径约 2cm的脱脂棉， 置于平皿盖的内面中央，其上滴加10% 氢氧化钠溶液约5ml；在靠近脱脂棉的一侧放置焦性没食3 子酸约 0.5g, 注意暂勿使两者接触，立即将已接种好的平板覆盖于平皿盖上，迅速用融化的石蜡密封平皿边缘周围。封毕，轻轻摇动平皿， 使被氢氧化钠溶液浸湿的脱脂棉与焦性没食子酸接触，然后置37恒温箱中培养之。干燥器培养法是于干燥器底部放入氢氧化钠溶液适量，然后再放入 2-3 个略高于液面的玻璃圆柱（如链霉素小瓶），将适量焦性没食子酸用纸或纱布包好，放置于圆柱上面，使暂勿与氢氧化钠接触，然后放下隔板，将已接种的培养皿或试管置于隔板上，待一切准备好后， 将盖盖好密封， 并轻轻摇动干燥器， 使焦性没食子酸落入氢氧化钠溶液中。（2）高层琼脂柱摇震培养分离法取长约 15cm ，直径约 5mm 的玻璃棒一支，一端塞以小木塞，另一端塞以棉花塞，高压灭菌备用； 加热融化一管适合分离厌氧菌用的琼脂培养基，待冷却至50左右，接入少许经适当稀释的待分离的培养物或含菌材料，充分摇震均匀；在琼脂凝固前，迅速以无菌滴管吸取上述已接种的琼脂培养基，注入上述（1）准备好的玻璃管内，置恒温箱中培养。（3）连二亚硫酸钠法将已接种的平板或斜面培养基，置于一玻璃干燥器内（预先测出体积），按每 1000ml 容积称取连二亚硫酸钠（又称保险粉）和无水碳酸钠各4g，并分别研细均匀，临用前混合置于一平皿内， 放在培养基上层， 然后将盖盖严， 用凡士林密封，置 37恒温箱中培养。2）二氧化碳培养法少数细菌如布氏杆菌（牛型） ，在含有10% 二氧化碳的环境下生长良好。要创造这样的环境， 常用的方法为烛缸法。 将接种的培养基置玻璃干燥器或其他可以密闭的玻璃缸内，于其内点燃一小段蜡烛，加上盖（盖边涂凡士林以防漏气），约一分钟左右蜡烛熄灭，此时缸内氧气已被耗尽，缸内所含二氧化碳约10% 。注意蜡烛勿太长， 而且不宜靠近缸壁， 以免因局部玻璃过热而破裂。凡士林不能太多也不能太少，多了盖子滑落，少了则封口不严。4. 真菌的分离培养法（简单介绍）应用细菌的平板分离法（划线、倾注） ，能容易而满意地得到真菌的纯培养。划线法： 2-5 天长霉菌。4 1）取琼脂培养基熔化，冷却至45，注入无菌平皿中，每皿15-20ml，作成平板待用。2）取要分离的材料（如田土、混杂的或污染的真菌培养物、真菌）少许，投入盛无菌水之试管中，摇振，使分离菌悬浮水中。3）将接种环经火焰灭菌并冷却后，蘸取上述悬浮液，进行平板划线。4）划线完毕，置温箱中培养2-5 天，待形成子实器官后，钓取单个菌落的部分，制片检查。若只有一种菌生长， 即得纯种。另外，亦可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养， 即可获得该种真菌的纯培养。5. 自患病动物病料中分离病原菌方法（简单介绍）1）琼脂斜面分离法取琼脂斜面三管，用接种环蘸取欲检病料少许（如为脏器，现将表面灼烧后，用灭菌解剖刀切开，以接种环由切面钓取组织），混合于第一管的凝集水中，再做斜面划线；然后取出接种环，不经烧灼，继续在第二管、第三管斜面上作同样的划线。 划毕，置温箱中培养。 经此法分离培养后， 第二管的菌落较第一管为少， 第三管的菌落更少， 如此较易得到单个菌落， 达到纯培养之目的。2）琼脂平板涂布分离法液体被检病料如血液、腹水等，可用灭菌毛细吸管或吸管吸取， 置 1-2 滴于平板中央， 用 L 形玻棒或玻璃刮铲作均匀涂布。如为脏器病料，可先做成乳剂再行涂布；或取其一小块，用镊子夹住，表面烧烙后，用灭菌刀切开，以其切面直接进行涂布。此法适用于含菌量较少的病料的分离。3）通过试验动物分离法被检材料中疑有某种病原菌存在，可将病料接种于有易感性的动物体内， 如疑有猪丹毒杆菌存在的病料，可注射于鸽体， 鸽死后，再取其脾脏以分离猪丹毒杆菌，常可得到纯培养。四、钓菌和纯培养被检材料经分离培养后， 选择欲分离的可疑菌落， 用灭菌接种环 （针）钓取少许，接种在新的培养基上， 称为钓菌。 钓取一个菌落培养出来的细菌培养物，称为纯培养。纯培养的目的在于进一步进行微生物学检验和其他试验研究。方法：首先用肉眼或放大镜观察并选择可疑的单个菌落，然后以蜡笔在可疑菌落下面的平皿底上作一记号， 用灭菌的接种环 （针）轻轻接触菌落， 蘸取菌料少许，5 作抹片，染色，镜检。如其形态一致， 即接种于适当的培养基上， 置温箱中培养。6. 细菌和真菌的移植方法（简单介绍）1） 接种环移植法 : 以左手持长有细菌 （或真菌）的菌种和无菌的琼脂斜面各一管，管口并齐， 管底握于掌中， 以右手作握笔状紧执接种环，并进行火焰灭菌；以右手的小指和无名指扭开并夹住第一管的棉塞，无名指和中指扭开并夹住第二管的棉塞，或以小指和无名指同时扭开并夹住两管的棉塞。将管口通过火焰灭菌， 然后用烧灼灭菌后的接种环插入菌种管内，钓取少许菌料， 接种于无菌的琼脂斜面上。同样将管口通过火焰灭菌后，塞好棉塞， 最后将接种环烧灼灭菌， 用蜡笔在试管上标记菌名、 日期，置温箱中培养。 厌氧菌移植常用培养基和培养方法如上述钓菌项。2）吸管或注射器移植法: 移植定量的液体培养或表面有液体石蜡的厌氧菌培养物，一般也可以利用吸管或注射器移植，其操作方法系以无菌吸管或无菌注射器吸取培养物，代替接种环进行移植。四、示教1. 用普通琼脂平板做一次划线分离培养：点上酒精灯，取实验三所做好的普通琼脂平板，倒置，将培养基靠近酒精灯呈45 度打开，然后用铂金耳钓取一环菌在培养基上划线，选四种（方格划线、蛇形划线、区域划线、交叉划线）画法中的一种。2. 用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养：手拿大肠杆菌的培养试管和一管肉汤培养基，充分震荡。靠近酒精灯，灼烧管口，充分灼烧铂金耳，放到酒精灯旁边放凉，打开试管塞， 灼烧试管口， 将铂金耳钓取一环菌， 然后将铂金耳放到肉汤培养基，摇晃。灼烧铂金耳，灼烧试管口，把试管塞上。充分灼烧铂金耳。将接好试管和铂金耳放到试管架。3. 用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养：用相同的方法接种， 在斜边培养基上划线。放到温箱培养。4. 用划线法进行真菌的分离培养（示教） ：与细菌的划线培养相同，画好线后放如温箱培养（ 30） ，2-5 天，待形成子实器官后，钓取单个菌落的部分，制片检查。若只有一种菌生长，即得纯种。另外，亦可在放大镜的观察下，用无菌镊子夹取一段待分离的真菌菌丝，直接放在平板上作分离培养， 即可获得该种真菌6 的纯培养。五、实验中应注意的问题1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。 大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。2）防止污染。分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。还可以反过来做抹片染色观察。六、作业1. 为什么要进行细菌的分离培养？2. 进行分离培养应注意哪些事项？3. 细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4. 叙述真菌的划线分离方法。七、本次实验总结1. 掌握划线法，熟悉四种划线方法。以及细菌的移植方法。2. 在操作过程中要防止污染。 分离培养的整个过程要严格无菌操作。培养基和一切用具必须彻底灭菌； 操作时必须靠近火焰； 操作完毕后， 禁止再让培养基接触外界空气。3. 操作的过程中要注意不要让接种器械过热。防止杀死细菌或真菌， 如接种环在烧灼灭菌后， 不能立即钓取细菌材料， 应在酒精灯旁凉凉； 另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。八、附：实验四：细菌的划线分离与培养实验所需物品7 一、试验材料名称组别数量合计备注1、酒精灯 5 2 10 火机（柴）2、接种环 5 2 10 3、培养基自备用前融解普通琼脂4、菌种大肠杆菌肉汤、金黄色葡萄球菌斜面每组各1 管5、病料粪便6、霉菌菌种7、真菌培养基（马铃薯葡萄糖培养基，应提前制备平板每班2 个）8、9ml 生理盐水试管4 只9、5ml 吸管10、吸球11、酒精棉球二、仪器设备名称1、 干燥箱 1 台2、 水浴锅 1 台3、 培养箱 1 台8 表 1、试验仪器设备统计表学院牧医工程实验室名称畜牧微生物实验名称实验四细菌的