1稿号：稿号：2012-225，收稿日期：，收稿日期：2012-5-3 牛乳腺炎金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白牛乳腺炎金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白 N 端蛋白端蛋白 nEBPS 基因的克隆及序列分析基因的克隆及序列分析薛晓阳1、2，吴金花1，布日额1*，王学理2，刘洋1、2，刘燕1，西林高娃1，孙立杰1，郭闯1，薛江东2（1.内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028043；2. 内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽 028043）【摘要摘要】根据 Genbank 上公布的金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白 N 端蛋白 nEBPS 基因的全序列，利用生物学软件 Primer5.0 和 Oligo 6.0 设计了一对特异性引物，采用 PCR 方法扩增了内蒙古分离株的 nEBPS 基因序列。结果表明，扩增的基因片段长度为 720bp， 与标准菌株（CMCC26074）的 nEBPS 基因片段序列相似性为 100%， 与 GenBank 上公布的金黄色葡萄球菌菌株（U48826.2）nEBPS 基因相似性达到 97.36%，为进一步研究该致病菌的发病机制和建立分子检测技术奠定了一定的实验基础。【关键词关键词】金黄色葡萄球菌；nEBPS 基因；克隆；序列分析Cloning and sequencing of fibronectin flexibble N-terminal protein nEBPS gene of Streptococcus aureus from mastitis cows XUE Xiao-yang1、2, WU Jin-hua1, BU Ri-e1,WANG Xue li2, LIU Yang1、2 , XI Lin gao wa1, SUN Li jie1, GUO Chuang1, XUE Jiang dong2 （1. College of Life Science, Inner Mongolia University for Nationalities ，Tongliao 028043, Inner Mongolia, China; 2.College of Animal Science and Technology, Inner Mongolia University for Nationalities） 【Abstract】A pair of primers were designed by biological software of primer 5.0 and Oligo 6.0 according to fibronectin flexible N-terminal protein nEBPS gene sequences of bovine mastitis Staphylococcus aureus published on GenBank. nEBPS gene fragment of clinical isolated strain was amplified by PCR. Sequencing result showed that nEBPS gene sequences had 720bp in length. nEBPS gene sequences of clinical isolated strain had 100% of homology with the standard strain（CMCC26074） in gene sequences, and had 97.36% of homology with the EBPS gene sequences of standard S. aureus strain (U48826.2) published on GenBank. The bovine mastitis Staphylococcus aureus nEBPS gene had been cloned and sequenced. This result had laied a foundation for further study on the pathogenic mechanism and establishment of a molecular detecting method for Staphylococcus aureus in dairy milk. 【 Key words】 Staphylococcus aureus；nEBPS gene；cloning; sequencing*【基金项目】国家自然科学基金项目（No.31060325） ；内蒙古自治区科技厅科技创新引导 计划项目（2011 年、2012 年） 。 *【通讯作者】布日额，Tel：0475-8314626，E-mail：wjhbreyahoo.com.cn 【作者简介】薛晓阳（1985- ） ，男，黑龙江省阿城人，在读研究生，主要从事病原微生物 及生物制品研究。奶牛乳腺炎（Diary cow mastitis）是造成乳业损失最严重的疾病之一，其病原种类较多，其中作为传染性致病菌的金黄色葡萄球菌（S. aureus，SA）是最为重要的致病菌之一。根据近几年我们对内蒙古地区牛乳腺炎致病菌的收集与分离，结果表明金黄色葡萄球菌的分离率为30%左右1，与国内其他学者的报道结果相一致2。随着奶牛集约化养殖模式的不断扩大，人工饲料的使用量逐年大增，奶牛摄入各种药物添加剂的几率也在加大。同时目前对奶牛乳腺炎的防治主要采用多种抗生素，从而使得国内外有关“多重耐药性金黄色葡萄2球菌”（Multidrug Resistance S. aureus,MRSA）的报道也日益增多，极易引起感染的暴发流行3、4。产肠毒素性 MRSA的严重危害性在于对多数抗生素变得不敏感，同时感染人体后造成难于治愈的致命性感染和肠毒素中毒，由其引起的感染与乙型肝炎、艾滋病已被称为当今世界三大感染性疾病。老年体弱、消耗性疾病患者、免疫缺陷者、大手术后、长期住院患者是易感人群，这些人群也正是乳品消费群体，乳源性感染几率也相对高5。因而使得乳源性致病性金黄色葡萄球菌 的检测，尤其是具有多重耐药性的金黄色葡萄球菌的检测与防控已经 成为目前乳品安全领域备受关注的民生课题6、7、8。因此研究和建立牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的快速分子检测方法，对其进行预警性监测，明确其传播机制及溯源方面具有十分重要价值，对牛保障广大乳品消费者的身心健康具有重要意义。研究发现，致病性金黄色葡萄球菌主要通过其表面的弹性纤维结合蛋白(EBPS)与宿主的细胞外基质结合，从而引起宿主的感染4，所以EBPS是致病性金黄色葡萄球菌所具有的重要致病因子，在对宿主的侵染过程中起到主要作用 9。EBPS基因组全长基因为1486bp，编码的EBPS蛋白分为N端、三个疏水区和C端。其中N端59个氨基酸暴露于细胞膜外，是属于该致病菌表面蛋白。因此，我们选择N端序列为靶片段，通过对其克隆与测序，为进一步进行体外表达、制备相应抗体，研究其致病机制及建立快速分子检测与预警性监测方法奠定实验基础。材料与方法材料与方法1 菌株来源菌株来源 金黄葡萄球菌标准菌株（CMCC26074）为中国普通微生物菌种保藏管理中心产品。2 培养基及抗生素培养基及抗生素 营养肉汤培养基、血液琼脂平板、LB 培养基等自备。糖发酵反应管、药敏纸片等为杭州天和微生物试剂有限公司产品。3 主要质粒和试剂主要质粒和试剂 克隆载体 pMD18-T Vector 和 DH5 为大连宝生物工程有限公司产品。PCR buffer、dNTP mix、Taq 酶等为大连宝生物工程有限公司产品，普通琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、蛋白酶 K、溶菌酶为北京索莱宝科技有限公司产品。其他试剂均为国产分析纯级产品。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。4 仪器与设备仪器与设备 Mastercycler ep gradient PCR 仪为德国 Eppendorf 公司产品；DYCP-6C 型电泳仪为北京市六一仪器厂产品；HC-2518R 型高速冷冻离心机为中科中佳公司产品；HZQ-F160 型智能震荡培养箱为哈尔滨市东联电子开发有限公司产品。5 细菌的分离及鉴定细菌的分离及鉴定 将采集的新鲜牛乳样用接种环接种于营养肉汤培养基中，37培养 24h 增菌。将增菌培养液划线接种于普通琼脂平板上，置 37培养箱培养 18h24h，观察菌落形态。挑取单个可疑菌落涂片，革兰氏染色、镜检，然后进行纯化培养；同时划线接种血液琼脂平板，置培养箱 37 培养 24h，观察培养特性。5.1 糖发酵试验 使用葡萄糖、麦芽糖、棉子糖、乳糖、果糖、蔗糖、甘露醇等进行发酵3试验。取 18h24h 的细菌，接种在糖发酵管中，置 37培养 24h48h，观察指示剂颜色及产气现象，如果指示剂由紫色变为黄色，表明糖类被发酵而产酸；若指示剂不变色，表示其对糖类不发酵；若发酵管顶部有气泡出现，表示产气。5.2 血浆凝固酶试验 将 14 的兔血浆 0.5 mL 置于洁净灭菌的小试管中，再加入细菌悬液 0.5 mL，摇匀，观察血浆凝固情况。试验设标准阳性菌株对照和生理盐水阴性对照。5.3 接触酶试验 用接种环挑取新鲜的纯化菌落置于洁净载玻片上，滴加一滴 3%的过氧化氢溶液，观察结果。5.4 甲基红试验 取少量在 37 培养了 24h48h 的培养液于另一试管内，加数滴甲基红试剂，培养液呈红色为阳性；呈黄色为阴性，需继续培养 4d5d 后再进行试验。6 PCR 扩增金黄葡萄球扩增金黄葡萄球 nEBPS 基因基因 6.1 PCR 引物的设计 根据 GenBank 中公布的 Staphylococcus aureus（U48826.2）的EBPS 基因序列，利用 Primer 5.0 和 Oligo 6.0 软件设计引物。上游引物序列：5-GCTGGTACCATGGGTGTTTCTA-3；下游引物序列：5-ACCGGATCCGTAGTATTGAATTG -3。用该对引物扩增的 nEBPS 基因片段预期长度为720bp。6.2 模板制备 采用常规溶菌酶、蛋白酶 K 消化，氯仿/异戊醇抽提的方法1。6.3 目的基因的 PCR 扩增 反应体系（25l） ，10 PCR buffer（Mg2+）2.5 l，dNTP（2.5 mmol/L）mixture 2 l，模板 DNA 2 l，上游引物（20pmol/l）1l，下游引物（20pmol/l）1 l，Taq 酶（5U/l）0.5 l，ddH2O 16 l。PCR 反应条件：94预变性 5 min；94变性 30 s，56退火 30s，72延伸 30s，共 30 个循环；72延伸 1min，4保存。6.4 PCR 产物的电泳鉴定 取 50l 的 PCR 产物进行 0.9%琼脂糖凝胶电泳，在紫外透射仪下观察电泳条带并拍照。7 PCR 产物的克隆和序列测定产物的克隆和序列测定 按照 Solarbio 生物公司琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书回收 PCR 产物，将胶回收产物连接 pMD18-T 载体。连接体系（25 l）：2T4连接酶 buffer 5 l，pMD18-T Vector 1 l，模板 DNA 1 l，T4DNA 连接酶 1 l，ddH2O 2 l。将连接产物转化感受态大肠埃希菌 DH5，转化菌涂布于含有氨苄青霉素的营养琼脂培养基上，并进行蓝白斑筛选。挑取白斑于含氨苄青霉素的 LB 培养基中，37 震荡过夜培养，然后按照质粒提取试剂盒提取重组质粒 DNA，阳性克隆质粒命名为 pMD18-T-nEBPS。用 PCR 方法快速鉴定阳性克隆，反应条件同前。阳性质粒送上海生工测序，将所获得序列与