KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/TNF- 基因多态性与分泌性中耳炎的关联基因多态性与分泌性中耳炎的关联作者：谭慧欢，黄海玲，解继胜，赵琼芝 作者单位：广西百色市人民医院，右江民族医学院附属西南医院耳鼻喉科，广西百色533000;右江民族医学院组织与胚胎学教研室，广西百色 533000【摘要】 目的 探讨 TNF- 基因启动子-238G/A 多态性与分泌性中耳炎(SOM)的相关关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP)检测 125 例 SOM 患者和 130 例健康对照者 TNF- 基因启动子-238G/A 多态性。结果 TNF-238 基因型 GG、GA 频率在对照组和 SOM 组分别为 93.85%，6.15%和85.60%，14.40%;等位基因 G、A 频率在对照组和 SOM 组分别为96.92%，3.08%和 92.80%，7.20%。两组差异均有显著性(P0.05)，携带 GA 基因型个体患 SOM 的风险约是 GG 基因型的 2.565 倍(OR=2.565，95%CI=1.0726.138)。结论 TNF-238 基因多态性与SOM 的发病有相关性，A 等位基因可能是 SOM 的遗传易感基因。【关键词】 肿瘤坏死因子-;基因多态性;中耳炎，伴渗出液The association of gene polymorphism of tumor necrosis factor-alpha with secretory otitis mediaTAN Hui-huan, HUANG Hai-ling, XIE Ji-sheng, ZHAO Qiong-zhi1. Baise Peoples Hospital, Department of Otorhinolaryngology, KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/Affiliated South-west Hospital ofYoujiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, China;2. Department of Histology and Embryology, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, ChinaAbstract: Objective To examine the association between polymorphism of tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha)-238 G/A promoter with secretory otitis media (SOM). Methods The polymorphism of TNF-alpha was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) methods in 125 patients with SOM and 130 healthy controls. Results TNF-alpha genotype frequencies of GG, GA were 93.85%, 6.15% and 85.60%, 14.40% in SOM group and control group, respectively. Allele frequencies of G, A were 96.92%, 3.08% and 92.80%, 7.20% in SOM group and control group, respectively. There was statistically significant difference in frequencies of allele and genotype in TNF-alpha polymorphism between SOM group and control group (P0.05). The relative risk suffered from SOM in patients with GA genotype was as 2.565 times as those with GG genotype (OR=2.565, 95%CI=1.0726.138). Conclusion TNF-alpha-238 polymorphism is positively associated with the genesis of SOM, and A allele maybe a risk factor for SOM.Key words: tumor necrosis factor-alpha; gene polymorphism; KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/otitis media with effusion分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)是以中耳积液及听力下降为主要特征的中耳非化脓性炎性疾病，小儿的发病率比成人高，是引起小儿听力下降的重要原因之一。目前 SOM 发病确切机理尚未完全明了，近年国内外的研究1表明免疫反应与 SOM 的发病关系密切，其中肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor alpha,TNF-)在 SOM 免疫反应中的作用日益被耳科学者重视，已成为研究 SOM 发病机理的活跃领域。有研究证实2，TNF- 基因多态性与多种疾病相关，但 TNF- 基因多态性与 SOM 是否关联，目前尚不清楚，为此，我们采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，探讨 TNF- 基因多态性与 SOM 的关系，为揭示 SOM 的发病机理提供一定的实验依据和新的视角。1 对象与方法1.1 研究对象SOM 组：经纯音测听、声导抗测试、鼓膜穿刺等检查确诊为 SOM 患儿(排除鼻咽部疾病者)125 例，男 68 例，女 57 例，年龄316 岁，平均 9.8 岁;病程 116 周。对照组：正常健康体检，无中耳炎病史、耳部正常儿童 130 例，男 68 例，女 62 例，平均 10.4岁。1.2 方法1.2.1 模板 DNA 的制备采集体检健康者静脉血 2ml，用 EDTA-K2 抗凝;采用已建KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/立的改良碘化钠法提取白细胞基因组 DNA，-30保存备用。1.2.2 引物合成参照文献3设计合成一对引物(北京赛百盛有限公司合成)，扩增 TNF- 基因启动子区的一段 DNA 序列。上游引物：5-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3，下游引物：5-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3。1.2.3 PCR 扩增条件PCR 反应体系包括 5.0l 基因组 DNA，2.5l 10PCR Buffer，2.0l 2.5mmol/L dNTPs, 1.5l 25mmol/L MgCl2，引物各20 pmol/l，Taq DNA 聚合酶 1.25u，所有试剂均为大连宝生物公司产品。PCR 反应循环参数：95预变性反应 3min;94变性50s，59退火 1min，72延伸 1min，33 个循环;72延伸5min，4保存，以上反应均在 GeneAmp PCR System 2700 型(美国PE 公司)基因扩增仪上完成。1.2.4 扩增产物的限制性酶切取 PCR 扩增产物 10l，用 10u 限制性内切酶(英国 Biolabs公司提供)Msp I 于 37酶切 1h。反应终止后，产物经 8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，EB 染色，染色后以 DNA 片段长度标准物为参考，在紫外灯下判断结果，并拍照。1.3 统计学处理用基因直接计数法计算 TNF- 的基因型及等位基因频率，疾病组和对照组间基因型及等位基因频率用 2 检验，均在 SPSS11.0KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/软件包上完成。2 结果2.1 TNF- 基因型分析TNF- 基因-238G/A 多态性，PCR 扩增产物片段大小为152 bp，根据限制性内切酶 Msp I 酶切片段的情况，基因型有两种，GG 型(133 bp、19 bp 2 条带)、GA 型(152 bp、133 bp、19 bp 3 条带)，在两组人群中均未检出 AA 基因型，见图 1。2.2 SOM 组与对照组 TNF- 基因多态性的比较TNF- -238G/A 位点基因型在两组中的分布差异有显著性(2=4.732，P0.05);等位基因频率在两组中差异有显著性(2=4.478，P0.05);SOM 组 TNF- GA 基因型明显升高，关联分析结果显示，SOM 组与 TNF- 基因多态性存在关联(2=4.732，P0.05，OR=2.565，95%，CI=1.0726.138)，见表1。表 1 两组 TNF- -238 基因型及等位基因频率分布的比较 (略)3 讨论TNF 是一种促炎细胞因子，主要由单核或巨噬细胞分泌，包括 TNF- 和 TNF- 两种。它可诱导自身及 IL-1、IL-6 等其它细胞因子产生，增加白细胞相关抗原(HLA)-、类抗原表达，促进T、B 淋巴细胞增殖及免疫球蛋白的合成，具有广泛的诱导炎症和调节免疫的功能。近年研究证实4，适量的 TNF 可调整机体的免疫及代谢作用，在维持机体内部环境的稳定状态及抵制各种致病因子具有重要意义，但是过量的 TNF 则会导致各种病理改变。KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/随着分子生物学和分子遗传学研究的不断深入，人们已经认识到基因的多态性可以造成某些疾病不同的易感性。人 TNF 基因位于第 6 号染色体短臂 MHC 类基因区一段长 7 kb 的 DNA 序列内，其中 TNF- 基因长 4 kb，含 4 个外显子和 3 个内含子。有研究证实5TNF- 基因启动子区域-238 位点存在 G/A 多态性，这种基因多态性的存在可能影响 TNF 基因转录和表达，进而影响 TNF的生物学功能，可导致 TNF 的血清水平发生改变。SOM 发病确切的发病机理尚未明确，目前认为咽鼓管功能障碍、感染和免疫反应是三大致病原因，此外家族中有中耳炎患者为患病的危险遗传因素。大量研究表明，TNF- 基因-238 位点多态性与青春期单发关节炎6、慢性乙肝7和口腔鳞状细胞癌8等多种疾病存在密切相关性，但 TNF- 基因多态性与 SOM 是否存在关联性的研究很少。因此，我们检测了 125 例 SOM 患者 TNF- 基因-238 位点多态性的分布，从遗传和免疫反应角度探讨 SOM 的发病机理。实验结果发现，TNF- -238G/A 位点基因型在两组中的分布差异有显著性(P0.05);等位基因频率在两组中的差异也存在显著性(P0.05);其中携带 GA 基因型个体患 SOM 的风险约是 GG 基因型的 2.565 倍(OR=2.565，95%，CI=1.0726.138)，提示 A 等位基因可能是 SOM 的遗传易感基因。综上所述，SOM 是一种可严重影响小儿听力的常见病，除上述因素外，遗传因素在其中也起着重要的作用，通过我们的研究KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/可以发现，TNF- 基因-238G/A 位点多态性与 SOM 存在关联，A等位基因可能是 SOM 的遗传易感基因。TN