综合实验综合实验实验名称：实验名称：区带毛细管电泳法测定中药槐米中芦丁的含量班级：班级：化学学院 10 级（2）班姓名：姓名：李宴轲学号：学号：33100218一、一、 实验目的实验目的1、初步掌握毛细管电泳法的原理2、掌握毛细管电泳仪和微波辅助萃取装置的使用方法3、掌握中草药定量分析的基本过程及方法二、二、 实验原理实验原理毛细管电泳法(CE)，又叫高效毛细管电泳（HPCE） 。CE 统指以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间的淌度和分配行为上的差异而实现分离的一类液相分离技术。图 1、高效毛细管电泳仪示意图毛细管电泳的突出特点是：a、毛细管电泳的仪器简单、操作简便，容易实现自动化b、分析速度快，分析效率很高c、操作模式多，分析方法开发容易d、实验成本低、消耗少e、应用范围极广三、三、 仪器及试剂仪器及试剂1、仪器高效毛细管电泳仪微波消解系统色谱工作站台式离心机2、试剂槐米，芦丁标准品，无水乙醇，硼砂，NaOH,二次蒸馏水四、四、 实验步骤实验步骤1、样品溶液制备草药槐米经烘干、粉碎，过 40 目标准筛。准确称取 0.10g 粉末于微波消解罐的内套中，加入 10mL 乙醇，将内套放入消解罐外套中，整个消解罐在密闭的状态下置于微波萃取装置中，在控制温度 100C的条件下，萃取 2min。萃取结束后，待消解罐冷却至室温后开罐，萃取液经过抽滤出去固体后，用无水乙醇定容至25mL。2、缓冲溶液配置（1）准确称取 Na2B4O710H2O 固体 9.5343g，在 100mL 的烧杯中用二次水溶解（需水浴加热） ，待固体全部溶解并冷却至室温后，定容至 250mL，即得到 0.1ml/L 的 Na2B4O7溶液。（2）用移液器取 0.1mol/L 的 Na2B4O7溶液 200L 用二次水稀释配置成 10mmol/L 的溶液 2mL，稀释两份，置于 2mL 离心管中，用作电泳缓冲溶液。3、毛细管电泳仪的操作要领（1）开机预热 20min。使用前须依次用二次水冲洗5min，0.1mol/LNaOH 溶液冲洗 5min，二次水冲洗 5min（2）设定工作温度 25C。（3）每次电泳前，须用二次水冲洗 2min，再用0.1mol/LNaOH 溶液，二次水冲洗 2min，再用缓冲溶液冲洗 2min。（4）本实验的进样条件为 0.5psi 压力，10s 时间。（5）电泳运行条件为 20KV，20min，在启动高压的同时，色谱工作站的记录系统也触发开始。（6）电泳结束后，在计算机的色谱工作站软件内保存好色谱图，记录峰面积。（7）实验结束对仪器进行冲洗，依次用二次水冲洗2min，0.1mol/LNaOH 溶液冲洗 2min，二次水冲洗2min，0.1mol/LNaOH 溶液冲洗 5min，二次水冲洗5min，0.1mol/LNaOH 溶液冲洗 10min，二次水冲洗 10min。4、槐米中芦丁含量测定（1）取槐米样品溶液 200L，置于 2mL 离心管中，加入 40L的 0.1ml/L 的 Na2B4O7溶液和 1760L 二次水，扣紧离心管盖子，摇匀并在离心管上做标记。（2）将装有配置好的样品溶液和缓冲溶液的 2mL 离心管放入离心机中，在 4000rpm 的转速下离心脱气 5min。（3）离心后得到 10mmol/L 的 Na2B4O7溶液即为本实验的运行缓冲溶液，做标记的样品溶液即为电泳仪可检测的样品溶液。（4）照前述电泳条件测定该样品溶液，得到谱图保存并打印。五、五、 数据处理数据处理1 1、绘制标准曲线。绘制标准曲线。得到标准曲线方程：Y=97+2099X(g/mL)2 2、从待测样品谱图中，根据峰保留时间确定芦丁峰，记录该峰的、从待测样品谱图中，根据峰保留时间确定芦丁峰，记录该峰的峰面积，从标准曲线上查得对应的浓度值。经过计算得出中药槐峰面积，从标准曲线上查得对应的浓度值。经过计算得出中药槐米中的芦丁质量百分含量。米中的芦丁质量百分含量。根据待测样品谱图和芦丁的标准电泳曲线的对比，得出芦丁峰的保留时间 9.650s，该峰的峰面积为 31811。根据标准曲线方程 Y=97+2099X(g/mL)得出待测样品中芦丁的浓度为 Y=15.11（g/mL） ，计算得到样品中芦丁的质量为 3.777mg，由于我们所取的槐米的样品质量为 0.1015g，因此计算得到中药槐米中的芦丁质量百分比芦丁质量百分比为 3.721%六、六、 思考题思考题1 1、简要说明毛细管电泳法（、简要说明毛细管电泳法（CECE）同液相色谱法（）同液相色谱法（LCLC）的区别）的区别与联系。与联系。答：答：CE 和 HPLC 相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 操作均可自动化, 且有多种不同分离模式。差异在于：（1）CE 用迁移时间取代 HPLC 中的保留时间, CE 的分析时间通常不超过 30min, 比 HPLC 速度快；其他分离存在两相，电泳是均相。（2）对 CE 而言,理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效高。（3）CE 所需样品为 nl 级, 最低可达 270 fl, 流动相用量也只需几毫升, 而 HPLC 所需样品为 l 级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但 CE 仅能实现微量制备, 而 HPLC 可作常量制备。2 2、进入毛细管电泳仪的溶液，为什么必须经过离心脱气这一、进入毛细管电泳仪的溶液，为什么必须经过离心脱气这一步骤？如果没有脱气，将会对实验结果产生什么样的影响？步骤？如果没有脱气，将会对实验结果产生什么样的影响？答：答：在多数的水溶液中，石英（或玻璃）毛细管表面因硅羟基解离会产生负的定域电荷，产生指向负极的电渗流。在毛细管中电渗速度可比电泳速度大一个数量级，所以能实现样品组分同向泳动。正离子的运动方向和电渗和电泳一致，因此它应最先流出。中性分子与电渗流同速，随电渗而行。所以说脱气处理是为了防止溶液中的气泡影响粒子的移动，而如果没有进行脱气处理，那么溶液中的气泡可能会因为影响粒子的移动而干扰正负电荷的分离，从而达不到预想的结果。3 3、微波萃取结束后，为什么要等到冷却之后才能开罐？、微波萃取结束后，为什么要等到冷却之后才能开罐？答：答：因为微波萃取的过程温度会升温到 100C，这是体系内的压强十分大，如果没有冷却就开罐，体系内过大的压强就会把消解罐内的塞子顶出来从而造成人员损伤。