以穿膜肽为载体的大鼠间充质干细胞磁共振体外成像 初步研究西安交通大学医学院第二附属医院影像中心( 7 1 0 0 0 4 ) 郭佑民刘敏郭晓娟王鹏段小艺 西安交通大学医学院( 7 1 0 0 6 1 ) 药学学院王嗣岑遗传教研室宋土生1 9 9 9 年S c i e n c e 杂志将干细胞研究列为当年十大科学研究之首。干细胞研究已成为生命科学的一个主攻热点。相应的干细胞移植后活体细胞“归巢”的示踪观察随之成为研究热点问题。穿膜肽( c e l lp e n e t r a t i n gp e p t i d e s ，C P P s ) ，是一大类可以携带多种分子穿过细胞膜结构的短肽，可以携带包括多种大小不同的物质进入细胞，这种特性为磁共振分子成像提 供了新的研究思路。本研究选取穿膜肽的基本序列之一对其重新构建，标记异硫氰酸荧光素( 记为C P P e - F I T C ) 及磁共振对比剂二乙酸胺五乙酸钆( 记为C P P e D T P A G d ) ，初步探讨穿膜肽携带的磁共振对比剂G d D T P A 干细胞体外摄取后分子显像的价值，为进一步体内成像实验奠定基础。材料与方法 1 实验材料与仪器：蛋白纯化工作站为岛津L c 一4 A 型高效液相色谱仪( H P L C 仪) ，纯化选用博碳纯化柱( P h a r m a c i a 公司美国) ，蛋白鉴定采用V o y a g e rM A L D I T O F 型质谱仪( 美国应用生物系统公司) 。氧化钆购于国药集团化学试剂有限公司( 上海，中国) 。钆喷替酸葡甲胺( G d D T P Ao m n i s c a n ) 为A m e r s h a mH e a l t h 公司( 爱尔兰) 产品。荧光显像使用德国L e i c a倒置荧光显微镜。细胞培养瓶及培养皿为C o r i n g 公司( 美国) 产品，D u l b e c c o 最低必须培 养液( D M E M ) 购自H y c l o n e 公司( 美国) ，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所，其余试验材料未经特殊标注均为S i g m a 公司( 美国) 产品。 2 穿膜肽的设计与合成：采用模肽( m o d e lc p p s ) 基本序列9 聚精氨酸( a r g i n i n et 。，R R R R R R R R R ) ，设计构建新目的多肽序列：L 型L A G R R R R R R R R R K 。记为C P P 。采用标准F m o c 固态合成方案，略加修改。选用聚乙二醇一聚苯乙烯树脂( R i n k r e s i nN o v a b i o c h e m 美国) 树脂， 按照多肽序列使肽链从羧基端逐个向氨基端延伸，氨基酸：树脂：4 ：1 投放。各氨基酸的仪氨基为9 一芴甲醇( F m o c ) 基团保护，其余侧链保护基团为标准保护基团，赖氨酸的8 一氨基采用 D d e 保护基。首先称取0 1m o l 替代值的R i n k 树脂，加入合成柱内并加入5m l - - 甲基甲酰胺( D M F ) ，膨胀3 0m i n 后，排出废液，加入3m l2 0 的吡啶，将合成柱置于3 7 。C 摇床摇动2 0m i n ，通入氮气吹干后加入D M F 清洗6 次，每次5m i n ，活化树脂。将活化的赖氨酸溶液加入合成柱内通人氮气反应2h A ，排出废液，D M F 洗3 次，此后按此加人活化的氨基酸溶液，直至最后1 个氨基酸，用D M F 清洗8 次，每次2m i n 。用羟基苯并三唑和苯并三唑四甲基脲四氟硼酸盐活化氨 基酸，第一个氨基酸赖氨酸C 一端羧基连接到R i n k 树脂上，每偶联完一个氨基酸后茚三酮反应检测偶联结果，用2o 哌啶溶液去除该氨基酸F m o c 保护基团，将活化的下一个氨基酸加入反应 柱内偶联，该过程循环直至最后一个氨基酸。肽合成后，用2 阱的二甲基甲酰胺溶液切割赖氨酸8 一氨基的D d e 保护基后与分别异硫氰酸荧光素( F I T C ) 及二乙酸胺五乙酸环酐( D T P A ad i e t h y l e n e t r i a l m i n e p e n t a a c e t i ca c i da n h y d r i d e ) 室温偶联过夜，D T P A a 偶联产物与氧化钆( G d = , O 。) ，振荡反应过夜，将切割液【三氟乙酸( T F A ) 8 2 ，苯酚5 ，去离子水5 ，苯甲硫醚5 ，二巯基乙烷3 】在冰浴条件下加人多肽合成柱，避光摇动3h A ，肽从R i n k 树脂和氨基酸侧链保护集团裂解下来，收集含肽裂解液。将含肽裂解液逐滴滴人1 0m l 冰乙醚中，C P P e 标记F I T C产物呈淡黄色沉淀，C P P e 标记D T P A G ( 1 产物呈白色沉淀，离心1om i n ，10 4r m i n d 弃上清，冰乙醚冲洗沉淀3 次，低温真空干燥2 4h ( 真空冰冻干燥机Y a m a t a 公司日本) ，得到粉状粗肽制品。3 多肽的纯化、分子量测定：利用飞行质谱( M s ) 鉴定产物及高效液相色普( H L P C ) 分离 纯化多肽。将合成肽用二甲基亚砜( D M S O ) 溶解，浓度为1 0m g m l ，纯化在岛津L c 一4 A 型H P L C5 3仪上进行，纯化选用博碳制备柱，流动相选用乙氰溶液( 岔0 i i 三氟乙酸) ，流率为4 0m l m i n ，经1 0 6 0 乙氰溶液梯度洗脱2 0m i n ，少量多次纯化，收集主峰，低温低压冻干后，一2 0 保存备用。C P P 。的分子量测定在V o y a g e rM A L D I T O F 型质谱仪上进行。4 弛豫效率测定：1 7o C ，4 0 0M H z 磁共振谱仪翻转恢复序列( I R ) 分别测定去离子水质子纵向弛豫时间T 。u 及C P P e D T P A G d 去离子水溶液中质子纵向弛豫时间T 根据1 T t 扎= I T + Rt【M 】计算纵向弛豫效率( r e l a x i v i t yR ) 。 5 干细胞分离：参照宋土生等方法，取1 月龄s D 大鼠1 只，雄性，体重7 6 9 ，断颈处死，取股骨和胫骨，注意保留骨端部分不受损伤。用7 5 ( 体积分数) 酒精浸泡1 5m i n 后移入超净工作台中。放置于干净的培养皿内晾干，剪去骨头两端，露出骨髓腔。用含1 5 ( 体积分数) F B S 的D M E M 培养液冲洗骨髓腔，反复2 次。含有骨髓细胞的培养液经打匀后接种于6 孔培养板中的3孔。于接种培养2 4h 后换液，并将换取的培养液移人另外3 孔，于接种后4 8h 后换液。从而形成0 2 4h 贴壁细胞和2 4 4 8h 贴壁细胞各3 孔。以后每天换液，连续3d 。3d 后改为每隔2d 换液。每天观察细胞形态并作记录。6 C P P e F I T C 摄取试验：待干细胞贴壁玻璃爬片后，新鲜配置浓度为2 5n m o l m lC P P e F I T C和F I T C 的含1 5 ( 体积分数) F B S 的低糖型D M E M 培养基培养，室温条件下分别孵育干细胞后弃去培养基，D - H a n k s 液冲洗细胞( 5m i n 次x3 次) 后倒置荧光显微镜观察细胞内荧光分布。7 C P P e D T P A G d 摄取试验：待干细胞至对数生长期时，新鲜配制浓度为5 0n m o l m lC P P e D T P A G d 和G d D T P A 上述含15 ( 体积分数) F B S 的低糖型D M E M 培养基培养溶液，分别孵育3 i 0 6 组细胞0m i n ( 空白对照细胞组) 、i 0m i n 、3 0m i n 、6 0m i n 、9 0m i n 后弃去培养基，D - H a n k s 溶液( p H = 7 4 ) 反复冲洗细胞( 5 m i n 次x3 次) ，0 2 5 胰酶消化，反复离心( 8 0 0r m i nxi 0m i n 次x2 次) 弃上清后，收集细胞团溶于4 0 0 斗1 含1 琼脂糖的D H a n k s 液中，加入5 0 0 斗1 的e p e n d o f f 管中待琼脂成胶胨状后，将e p e n d o f f 管固定于含1 琼脂糖的D H a n k s 液中。1 5T 隙采集F S E 序列T I W I ( T R4 4 0m s ，T E1 3m s ，F O V1 2m mx1 2m m ，层厚2m m ，层间距0 2m m ，矩阵2 8 8 1 9 2 ，N S A4 ，翻转角9 0 。) ，观察管内外信号特点，采用感兴趣( R O I ) 沿管内壁勾画感兴趣区，测定管内及管外琼脂信号密度，分析作用时间与 信号强度关系。同样新鲜配置浓度为0n m o l m l ( 空白对照细胞组) 、3 0n m o l m l 、6 0n m o l m l 、9 0n m o l m l 、1 2 0n m o l m lC P P e D T P A G d 和G d D T P A 上述含1 5 ( 体积分数) F B S 的低糖型D M E M 培养基培养溶液，分别孵育3X1 0 6 组间干细胞4 0m i n1 5TM RF S ET I W I 观察管内外信号特点，分析作用浓度与信号强度关系。 8 细胞毒性试验：利用四唑盐比色法( M T T 试验) 测定0n m o l m l ( 空白对照细胞组) 、3 0n m o l m l 、6 0n m o l m l 、9 0n m o l m l 、1 2 0n m o l m lC P P e D T P A G d 的对正常细胞的活力影响凋亡试验和细胞毒性试验：将干细胞分别等量种于9 6 孔培养板，待生长至i 0 4 孔时，分别加入上述5 个浓度1 8 0 斗l ，每个浓度设4 个平行组，C 0 2 孵箱中培养3d 后，每孔加入M T T 2 0 斗l ，继续培养4h 后弃去培养液，加入1 5 0 斗i - - 甲亚砜( D M S O ) ，全自动酶标仪振荡1 0m i n 后在5 7 0 6 90n m 波长测光吸收度A5 70 值。比较各浓度对细胞生长的影响。9 细胞凋亡分析：新鲜配置浓度为0n m o l m l ( 空白对照细胞组) 及1 2 0n m o l m l C P P e D T P A G d J l 述含1 5 ( 体积分数) F B S 的低糖型D M E M 培养基培养溶液，分别孵育3 1 0 6 组间干细胞3d 后，0 2 5 的胰酶消化，用P B S 洗2 次，加入F I T C ( 激发波长4 9 0n m ，发射波长5 2 0n m ) ，标记的A n n e x i n V ( 2 0 斗g m 1 ) 1 0 肛l ，室温避光3 0 m i n ，再加入P I ( 5 0 斗g m l 激发波长5 3 5n m ，发射波长6 1 7n m ) 5 斗l ，避光反应5m i n 后，P B S 清洗细胞2 次，即刻用流式细胞仪检测，按照F A C S C a l i b u r 配置软件测定数据。 1 0 对比剂对线粒体的膜电位的影响：新鲜配置浓度为0n m o l m l ( 空白对照细胞组) 、及1 2 0n m o l m lC P P e D T P A G d 上述含1 5 ( 体积分数) F B S 的低糖型D M E M 培养基培养溶液，分别孵育3xi 0 6