KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/人牙周韧带细胞和牙髓细胞表型特征的比较人牙周韧带细胞和牙髓细胞表型特征的比较人牙周韧带细胞和牙髓细胞表型特征的比较作者：吴莉萍 韦曦 凌均棨 刘路 作者单位：1.中山大学光华口腔医学院附属口腔医院 正畸科；2.牙体牙髓科，广东 广州 510055 【摘要】 目的 研究人牙周韧带细胞（PDLCs）和牙髓细胞（DPCs）表型特征以及体外传代对其表型特征的影响，为选择适宜的表面标记分选生物性状同源性的细胞亚群提供依据。方法 采用酶消化法体外培养 PDLCs 和 DPCs，免疫组化检测和流式细胞仪分析细胞表面标记的表达。结果 PDLCs 和 DPCs 的 STRO-1 和 CD146免疫组化染色阳性。流式细胞仪分析显示：获得的第 1 代 PDLCs和 DPCs 表达间充质干细胞表面标记 STRO-1、CD146、CD29、CD44 和 CD106，基本不表达 CD34。PDLCs 的STRO-1、CD29 和 CD44 阳性表达百分比与 DPCs 间的差异无统计学意义（P0.05） ，PDLCs 的 CD106 阳性表达百分比高于DPCs，CD146 阳性表达百分比低于 DPCs，且差异有统计学意义（P0.05）. PDLCs expressed significantly higher level of CD106 and significantly lowerlevel of CD146 than DPCs（P0.05） 。第 1 代 PDLCs 的 STRO-1、CD29 和 CD44 阳性表达百分比与 DPCs 间的差异无统计学意义（P0.05） ，PDLCs 的 CD106 阳性表达百分比高于 DPCs，CD146阳性表达百分比低于 DPCs（P0.05） ，其余各代细胞之间的差异均有统计学意义（P0.05） 。3 讨论成体 PDLCs 和 DPCs 中存在高度增殖和多向分化潜能的干细胞。目前，牙源性成体干细胞的鉴定和分选多采用 BMSCs 的表面标记，BMSCs 的表面标记抗原具有非特异性，表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面抗原 STRO-1、CD146、CD29、CD44 和CD106 等。其中 STRO-1 是 BMSCs 和幼红细胞前体细胞表达的细胞表面蛋白，对于 STRO-1 阳性的细胞，其成纤维细胞克隆形成单位（the frequency ofcolony forming units-fibroblasts，CFU-F）显著增加，能够分化形成多向间质细胞系4。因此，STRO-1 被认为是间充质干细胞标记，被广泛应用于 BMSCs 的纯化和鉴定。研究表明，STRO-1 阳性细胞群落表现出高度的增殖活力以及多向分化的潜能，显示出较均一的生物性状2，5。Yang 等6-7证实 STRO-1 阳性的牙髓细胞群具有更确定的多系分化潜能，STRO-1 阳性和未分选的牙髓细胞能够分化形成成牙本质细胞，STRO-1 阴性的牙髓细胞群显示KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/成纤维样细胞表型，不能分化形成成牙本质细胞。CD146 是一种细胞膜糖蛋白和内皮细胞黏附分子，主要表达于正常的间质组织，包括平滑肌细胞、内皮细胞、肌纤维母细胞和雪旺细胞，造血细胞不表达，其功能主要是通过跨膜信号参与各种细胞过程，包括黏附、细胞骨架重组、形态改变、迁移与增殖5。CD29、CD44 和 CD106分别是整合素家族标记、透明质酸酶/纤维结合蛋白受体和血管细胞黏附分子-1，参与造血细胞与骨髓基质细胞的黏附、增殖和迁移，被作为基质细胞和间质细胞相对特异性的表面标志8。CD34 一直被认为是造血系的始祖细胞或干细胞的表面抗原标记，BMSCs 不表达 CD34。本研究分离培养的第 1 代 PDLCs 与 DPCs 相似，表达STRO-1、CD146、CD29、CD44 和 CD106，基本不表达 CD34，具有与 BMSCs 相似的表型特征9。研究证实分离培养的 PDLCs 和DPCs 中均存在一定数量早期未定向分化的干细胞。同时，STRO-1/CD106/CD146 均为血管周细胞表面抗原，提示 PDLCs 和 DPCs 中的干细胞定位于所在微环境的血管周围5，10。最近，有学者利用 STRO-1/CD106/CD146 筛选来源于牙周膜和牙髓中的间充质干细胞，发现 STRO-1 阳性或 CD106 阳性的PDLCs 和 DPCs 均具有高度增殖能力，低密度接种形成细胞克隆，表达 CD44、CD166、核心结合因子 1、型胶原、骨涎蛋白和肌腱特有的转录因子 Scleraxis 等，植入免疫缺陷鼠体内分别形成牙骨质/牙周膜样结构和牙髓/牙本质复合体2，10。CD146 阳性的 DPCs不表达成牙本质特有的牙本质涎蛋白，属于未成熟的前成牙本质细KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/胞群，植入免疫缺陷鼠体内形成牙本质5。STRO-1/CD106/CD146均可作为有效分选干细胞的标记，但哪个表面标记更具应用优势仍不清楚。本研究发现 PDLCs 的 STRO-1 阳性表达百分比高于Nagatomo 等1报道的结果（1.2%） ，较 DPCs 的 STRO-1 阳性表达低，但差异无统计学意义，表明 PDLCs 和 DPCs 中 STRO-1 阳性细胞数量相近。PDLCs 中 CD106 阳性表达百分比与 Kern 等11报道的 BMSCs 中 CD106 阳性细胞结果相近。PDLCs 中 CD106 阳性表达百分比高于 DPCs，CD146 阳性表达百分比低于 DPCs，差异有统计学意义。这提示应用 CD106 或 CD146 对 PDLCs 或 DPCs 进行分选时具有不同优势，而 CD106 和 CD146 在 PDLCs 和 DPCs 的不同表达是否对于细胞功能具有重要作用尚需进一步研究。STRO-1 在未成熟细胞上有高水平的表达，当长期培养后大量其他分化抗原或细胞功能性标志物出现时，它们的水平明显下降12。将 STRO-1 和 CD146 同时用于筛选 BMSCs，发现 STRO-1/CD146 阳性的 BMSCs 的 CFU-F 增加 2103 倍，没有检测到成骨标记核心结合因子 1 和骨钙素（osteocalcin，OCN） ，经体外扩增后表达核心结合因子 1 和 OCN，提示 STRO-1/CD146 可以作为BMSCs 分化早期的标记5。Banfi 等13认为随着 BMSCs 大量扩增，会发生复制性老化。这种老化现象是由于 BMSCs 在体外扩增时缺失端粒酶活性或者是端粒酶活性减少，端粒酶在细胞分裂期间对维持端粒长度和染色体稳定发挥重要作用，加强端粒酶活性可以明显增强 BMSCs 的增殖生命期和成骨潜能14。STRO-1 阳性/碱性磷酸KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/酶阴性的 PDLCs 经过 21 d 培养后，克隆形成有效率自 60%下降至30%1。提示 STRO-1 是干细胞分化早期的标记物。本研究对STRO-1 和 CD146 阳性表达百分比进行多代追踪，发现 3 组不同来源 PDLCs 与 DPCs 的 STRO-1 或者 CD146 阳性细胞均随传代而逐渐减少，其中 STRO-1 阳性细胞减少较明显，推测 PDLCs 和 DPCs 在体外随着培养时间的延长，其中的干细胞可能发生自分化和老化，STRO-1 和 CD146 表达下降。本研究证实 PDLCs 和 DPCs 中存在一定数量的成体干细胞，干细胞成分随体外传代而减少。提示在利用 STRO-1/CD146 等表面标记分选生物性状同源性的细胞亚群时应选择扩增培养早期代数的PDLCs 和 DPCs，以便获得理想的种子细胞数目。【参考文献】1 Nagatomo K, Komaki M, Sekiya I, et al. Stem cell properties ofhuman periodontal ligament cellsJ. J Periodontal Res, 2006, 41（4）：303-310.2 Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotentpostnatal stem cells from human periodontal ligamentJ. Lancet,2004, 364（9429）：149-155.3 Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dentalpulp stem cells（DPSCs） in vitro and in vivoJ. Proc Natl AcadSci USA, 2000, 97（25）：13625-13630.4 Simmons PJ, Torok-Storb B. Identification of stromal cell KKME-专业医学搜索引擎 http:/www.kkme.net/pre-cursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody,STRO-1J. Blood, 1991, 78（1）：55-62.5 Shi S, Gronthos S. Perivascular niche of postnatal mesenchymalstem cells in human bone marrow and dental pulpJ. J BoneMiner Res, 2003, 18（4）：696-704.6 Yang X, Zhang W, van den Dolder J, et al. Multilineage poten-tial of STRO-1+ rat dental pulp cells in vitroJ. J Tissue EngRegen Med, 2007, 1（2）：128-135.7 Yang X, van den Dolder J, Walboomers XF, et al. The odonto-genic potential of STRO-1 sorted rat dental pulp stem cells invitroJ. J Tissue Eng Regen Med, 2007, 1（1）：66-73.8 Peister A, Mellad JA, Larson BL, et al. Adult stem cells frombone marrow（MSCs） isolated from different strains of inbredmice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differen-tiation potentialJ. Blood, 2004, 103（5）：1662-1668.9 Yamada Y, Fujimoto A, Ito A, et al. Cluster analysis and geneexpression profiles： A cDNA microarray system-based comparisonbetween human dental pulp stem cells（hDPSCs） and human me-senchymal stem cells（hMSCs） for tissue engineering cell therapyJ. Biomaterials, 2006, 27（