南京中医药大学硕士学位论文土槐消银方治疗进行期寻常型银屑病的临床观察及实验研究姓名：徐艳艳申请学位级别：硕士专业：中医外科学指导教师：魏跃钢20090601南京中医药大学硕上学位论文摘要目的：中医药治疗银屑病具有改善病情、延长疾病缓解期、副作用小等诸多优点，我们在临床上自拟方剂“土槐消银方治疗寻常型银屑病疗效满意，为确定此方的确切疗效及初步探讨其治疗机理，本课题进行了“土槐消银方治疗进行期寻常型银屑病的临床疗效观察及动物实验研究。方法：5 1 例纳入研究患者随机分为治疗组( 3 6 例) 与对照组( 1 5 例) ，疗程8 周，以P A S I积分为疗效判定标准。实验研究将4 0 只B A L B c d , 鼠随机分为空白组、模型组、对照组及实验组，给药2 0 天。第2 1 天，除空白组外，其余各组腹腔注射S E B2 51 tg 2 0 9 ，3 h 后四组均摘除眼球取血，离心后采用双抗体夹心A B C E L I S A 法测定血清T N F _ a 水平。同时各组动物处死，取鼠尾根向下2 c m 的一段表皮，行病理组织切片，计数鼠尾表皮1 0 0 个鳞片中有颗粒层的鳞片数。结论：土槐消银方组患者临床愈显率达6 3 9 9 6 ，明显高于对照组( P O 0 5 ) ，较空白组有显著性差异( P 0 0 5 ) M e a n w h i l e ，e x p e r i m e n ti n d i c a t e st h a tT uH u a iX i a oY i nF a n gc a na n t a g o n i z eT N F - ai n c r e a s ei n d u c e db yS E Bi nm o u s e Sb l o o d ( P 9 5 。( 2 ) 显效：皮损大部分消退，临床症状明显减轻，疗效指数 7 0 ， 3 0 ， 0 0 5 ) 二组间总有效率比较不具有统计学意义。图2 - 2 两组间疗效比较F i 吐- 2t h ec u r a t i v ee f f e c t c o n t x a s t b e t w e e n t h e t w og r o u p s6 2 两组治疗前后P A S I 积分比较表2 - 3 ：两组治疗前后P A S I 积分比较( i s D )T a b 2 - 3c o n t r a s to f t h es c o r eb e f o r ca n da f t e rt h et r c a r m e n治疗组与对照组患者治疗后病情评分较治疗前病情评分均明显降低，经t 检验分析，治疗前后两组的P A S I 积分比较均存在显著性差异( P 0 0 5 ) 。图2 - 3 两组治疗前后P A S I 积分比较图F i 9 2 - 3c o n t r a s to f t h es c o r eb e f o f ca n da f t e rt h et r e a t m e n6 3 安全性观察治疗期问治疗组有2 例出现服药后胃部不适，食欲不振，嘱其将空腹服药习惯改为餐后半小时服药后，未诉不适。南京中医药大学硕十学位论文第三章实验研究1 、实验材料1 1 实验动物B u 卫c 雄性小鼠，清洁级，重1 8 2 2 9 ，由扬州大学比较医学中心提供。合格证号S C X K ( 苏) 2 0 0 7 0 0 0 1 。1 2 饲养环境4 0 只受试动物随机分组，分笼饲养，饲全价营养颗粒饲料，自由饮水，室温为2 2 2，湿度5 9 6 5 。1 3 动物饲料动物饲料为全价营养颗粒饲料，由扬州大学比较医学中心提供。1 4 药物及制备( 1 ) 土槐消银方：土茯苓3 0 9 ，生槐花1 5 9 ，蛇舌草1 5 9 , 忍冬藤3 0 9 , 威灵仙1 0 9 ，丹参1 5 9 ，山豆根6 9 ，白鲜皮1 0 9 ，生甘草5 9上药采用江阴天江药业有限公司生产的中药配方颗粒剂型( 南京中医药大学第一附属医院药房提供，其所配方的每种中药颗粒剂量均相当于上方中各药的饮片量) ，根据实验预算，共得颗粒剂量1 3 8 9 ，每克颗粒剂相当于生药量9 8 6 9 。将所得颗粒剂溶于相应热蒸馏水中制成溶液浓度为0 1 3 8 9 m l 的药液。( 2 ) 复方青黛胶囊( 陕西天宁制药公司生产，国药准字Z 2 0 0 2 5 2 2 5 ，每粒装0 5 e )将9 粒复方青黛胶囊的内容颗粒溶于1 0 0 m l 热蒸馏水中，制成溶液浓度为0 0 4 5 9 m l 的药液。1 5 实验用仪器与设备低速台式离心机：T G L - 1 6 8上海安亭科学仪器厂酶标仪：D E N L E YD m 崛O NW e l l s c a nM K 3芬兰洗板机：W e l l w a s h4M K 2芬兰数字显示隔水式电热恒温培养箱：P Y X - D H S上海跃进医疗器械厂移液枪( 2 0 _ 2 0 0 u l 规格) ：T h e r m ol a b s y s t e m s显微镜和显微摄影系统：L E I C AD M l 0 0 0德国天平秤、量杯、注射器、灌胃针头、手术器械等由南京中医药大学动物实验中心提供1 6 主要试剂S E B ( 金黄色葡萄球菌肠毒素B )美I 亘S i g m a 公司小鼠册aE L I S A 试剂盒( 4 8 T ) 一R D 进口分装上海西唐生物科技有限公司2 、实验方法2 1 实验分组：B A L B c 小鼠4 0 只，饲养3 天，无不良反应，饮食、饮水、活动正常者纳入实验。随机分为4 组，每组1 0 只。1 3第三章实验研究2 2 给药方案：( 1 ) 空白组给予蒸馏水，平均灌胃量为0 5 m l 2 0 9 d( 2 ) 模型组给予蒸馏水，平均灌胃量为0 5 m l 2 0 9 d( 3 ) 对照组给予复方青黛胶囊灌胃，平均灌胃量为0 0 2 2 5 9 2 0 9 d( 4 ) 实验组给予“土槐消银方“ 中药灌胃，平均灌胃量为0 0 6 9 9 2 0 9 d ( 颗粒剂量)注：2 0 9 d 、鼠单位体重药量相当于6 0 k g 成人单位体重药量的1 5 倍。2 3 试剂配制：S E B 溶液配制：将l m gS E B 冻干粉溶于1 2 m l 蒸馏水中，配成8 3 3 u g m l 的S E B 溶液，置于4 冰箱保存备用。2 4 实验步骤：( 1 ) 饲养3 天后，按照既定给药方案对每组小鼠开始灌胃给药，连续2 0 天。( 2 ) 第2 1 天，空白组腹腔注射0 3 m l 2 0 9 的蒸馏水；除空白组外，其余各组小鼠均腹腔注射2 5 u g 2 0 9 的S E B 溶液，3 小时后各组小鼠摘除眼球放血，于离心机中以2 0 0 0 r r a i n 离心 2 0 m i n ，吸取上清，- 3 0 保存，采用双抗体夹, I 二, A B C - E L I S A 法测定血清中册a 水平( 具体操作由上海西唐生物科技有限公司实验室进行) 。( 3 ) 第2 1 天，各组取血后处死动物，取小鼠尾部距尾根2 c m 处切断鼠尾，尽量避免损伤，切开鼠尾皮肤，剥离软骨，取长度约2 c m 左右长方形皮片贴附于滤纸上，立即投入1 0 9 G福尔马林中固定，常规脱水，石蜡包埋，切片，H E 染色，用光学显微镜观察记录每1 0 0个鳞片中有颗粒层的鳞片数。( 病理切片染色由东南大学基础医学院病理教研室协助完成)2 5 统计方法实验数据均采用S P S S1 0 0 统计软件进行分析处理，实验结果以均数土标准差( X S D ) 表示，计量资料用单因素方差分析( O n e W a y A N O V A ) 检验，不符合正态分布的用非参数检验，计数资料用矿检验。3 、实验结果3 1 对小鼠皮肤颗粒层的影响表3 1 各组鼠尾有颗粒层的鳞片计数比较( T _ + S D )T a b 3 1c o n t r a s to ft h en u m b e ro fs c a l e se x i s t i n gg r a n u l a rl a y e ro fe a c hg r o u p ( x S D 、组别例数有颗粒层的鳞片数1 0 0 个鳞片注：实验中各组伤亡动物均冈操作不当而致，剔除出实验以上实验数据经统计检验符合正态分布，且具有方差齐性，用单因素方差分析1 4南京中医药大学硕士学位论文( O n e W a yA N O V A ) 检验，并选L S D 、D u n n c t t 和S N K 三种方法进行多重比较统计。F = 3 3 2 1 6 ，空白组与模型组比较不存在统计学意义( P = O 9 7 2 0 0 5 ) ，空白组分别与对照组、实验组之间具有显著性差异( P = O 0 0 0 0 0 5 ) 。3 2 对金黄色葡萄球菌肠毒素B 诱导小鼠T N F a 水平升高后的影响表3 2 用药后各组B A L B c d 、鼠血清T N F a 水平比较( i S D )T a b 3 - 2 c o n t r a s to f t h e B A L B c m i c e s s e r u m T N F - a o f e a c h g r o u p a f t e rt h ee x p e d m e n t ( X - - S D ) 组别例数TNF-a水平注：实验中各组伤亡动物均因操作不当而致，剔除出实验以上实验数据经统计检验符合正态分布，且具有方差齐性，采用单因素方差分析( O n e W a y A N O V A ) 检验，并选L S D 、D u n n e t t 和S N K 三种方法进行多重比较统计。四组之间两两比较均具有统计学意义( F = 7 1 0 8 2 ，P O 0 5 ) ，但也证明了土槐消银方在促表皮K C 分化方面与复方青黛胶囊作用相当。实验结果提示，土槐消银方具有抑制表皮K C 过度增殖，改善表皮角化不全的作用。此作用可能为土槐消银方治疗进行期寻常型银屑病的机理之一。4 2 2 免疫调节作用4 2 2 1T N F a 在免疫学说中的重要性目前，医学界已基本认同银屑病发病的关键环节在免疫异常，而在这个多细胞多层次2 1第四章讨论参与的特异性免疫反应中，众多研究证实，T N F - a 可能是银屑病免疫炎症反应的重要始动因子【矧，对银屑病的病理形成起重要作用。T N F - a 在银屑病皮损中可由单核巨噬细胞、角质细胞、表皮树突状细胞、肥大细胞和少量活化的T 细胞分泌。T N F a 在体内通过与受体P 5 5 结合，不仅能够诱导皮肤内黏附分 子( I 洲1 ) 的表达和淋巴细胞的浸润，促进郎格汉斯细胞的成熟，增强活化T 细胞的能力，进一步产生一系列炎症反应；而且还可以诱导K C 分泌过多的转化生长因子a ( T G F - a ) ，后者通过与表皮细胞表面的表皮生长因子( E G F ) 受体结合，促进K C 的增殖1 3 0 , 3 1 1 。M u s s i 发现银屑病患者外周血T N F a 的血清水平明显升高，并与疾病的严重程度密切相关【3 2 1 。国内刘晓雁等【3 3 】检测儿童寻常型银屑病患儿血清中T N F a 和I L 一6 、l L 一2 含量，结果显示