广卅I 医学院博士学位论文 Y8 U 9 1 5 - ：气道上皮损伤对上皮下成纤维细胞重塑的影响及其在气道高反应发生中的地位专业名称：学位申请人：指导老师：呼吸内科学陈兴无徐军教授广州医学院广州呼吸病研究所2 0 0 5 年5 月一! 茎奎翌璺塑垄室中英文对照词汇表E M T Ue p i t h e l i a l - m e s e n e h y m a lt r o p h i cu n i t上皮间充质营葬单位M M P sm a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e基质金属蛋白酶d - S M Ai x - s m o o t hm u s c l ea c t i nd 平滑肌肌动蛋白A I t Ra i r w a yh y p e r r e s p o n s i v e n e s s气道高反应性1 6 H B Eh u m a nb r o n c h i a le p i t h e l i a lc e l l人气道上皮细胞株H P B F sh u m a np r i m a r yb r o n c h i a lf l b r o b l a s t人原代支气管成纤维细胞E T - Ie n d o t h e l i n - 1内皮素1T G F - 口1t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - Bl转化生长因子BIa n t i - E C Ea n t i s e n s e - e n d o t h e l i nc o n v e r t i n ge n z y m e反义内皮素转换酶B A L Fb m n c h o a l v e o l a rl a v a g ef l u i d支气管肺泡灌洗液D M E Md u l b e c c o Sm o d i f i e dE a g l e 。Sm e d i u mD M E M 培养基M A P K sm i t o g e n - a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e丝裂原活化蛋白激酶L P Sl i p o p o l y s a e c h a r i d e脂多糖E L I S Ae n z y m e - l i n k e di m m u n o a d s o r d e n ta s s a y酶联免疫吸附试验D A P I4 6 D i a m i d i n e 一2 一p h e n y l i n d o t ed i h y d r o c h l o r i d eB r d U5 - b r o m o d e o x y u r i d i n e5 - 溴脱氧尿核苷F l u o - 3 A Mf l u o 一3a c e t o x y m e t h y le s t e rR T T Cr a tt a i lt e n d o nc o l l a g e nI 型鼠尾胶原E R Ee x t r a c e l l u l a rs i g n a lr e g u l a t e dk i n a s e胞外信号调节激酶R B Mr e t i c u l a rb a s e m e n tm e m b r a n e网状基底膜S E Fs u b - e p i t h e l i a lf i b r o s i s上皮下纤维化J N Kc - J u nN H 2t e r m i n a lk i a a s eW e s t e r nB l o t蛋白质免疫印迹法L S C Ml a s e rs c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y激光共聚焦扫描显微镜 C a 2 + ic y t o p l a s m i cf r e ec a l c i u mc o n c e n t r a t i o n细胞浆内游离钙浓度中文摘要气道上皮损伤对上皮下成纤维细胞重塑的影响及其在气道高反应发生中的地位学位申请人：陈兴无导师：徐军教授中文摘要研究目的：气道上皮的损伤与修复延迟是哮喘气道的典型病理特征。研究发现哮喘气道上皮下基底膜肌纤维母细胞增多，这些细胞的特点是表达a 平滑肌肌动蛋白( aS M A ) ，从而具有收缩潜能及较强的胶原合成能力。我们推测：损伤的气道上皮可能通过持续释放某些促成纤维细胞活化因子，经过一定的信号转导途径与基底膜细胞发生特定的信息交流，诱导了上皮下成纤维细胞的重塑、转分化为表达n S M A 的肌纤维母细胞，从而参与了气道高反应性的形成。为阐明这一可能的机制，本研究调查了损伤的气道上皮细胞对上皮下成纤维细胞活化、转分化的影响及其细胞因子信号调节机制，探讨哮喘特征性的气道结构细胞重塑在气道高反应发生中可能的地位。研究内容与方法：一、调查损伤气道上皮及与损伤上皮共培养的上皮下成纤维细胞释放E T 1的能力，探讨升高的E T 1 对气道成纤维细胞钙内流的影响：1 ) 对离体培养的人气道上皮细胞株( 1 6 H B E ) 给予机械划伤和或细菌脂多糖( L P S ) 刺激，检测培养上清中E T 1 的水平；2 ) 将正常或机械损伤的1 6 H B E 与上皮下成纤维细胞复合培养，观察上皮细胞对成纤维细胞E T 1 生成的影响；3 ) 基础状态或预先使用E T 受体A ( E T R A ) 阻断剂B Q l 2 3 孵育的上皮下成纤维细胞予E T 1 刺激，经钙离子荧光探针( F l u o 一3 A M ) 负载，激光共聚焦显微镜观察胞内钙的变化；二、研究损伤气道上皮对上皮下成纤维细胞增殖活化、转分化为肌纤维母细胞的影响与可能的细胞因子机制：中文摘要1 ) 将反义内皮素转换酶( a n t i E C E ) 核酸表达载体、对照空载体( p E G F P N 2 )等质粒分别转染1 6 H B E ，给予机械划伤f M ) 、机械划伤+ L P S ( L + M ) 刺激并与离体培养的人气道上皮下成纤维细胞共培养；在L + M 处理过的p E G F P N 2 转染1 6 H B E 与成纤维细胞共培养组，分别加入B Q l 2 3 ( 复合培养前4 5 m i n 加入) 或转化生长因子( T G F 1 ) 中和抗体，应用B r d U 掺入法检测成纤维细胞的增殖活性；2 ) 正常或损伤( L + M ) 的1 6 H B E 与上皮下成纤维细胞共培养并在损伤培养组分别加入B Q l 2 3 和或T G F Bl 中和抗体，应用免疫荧光、免疫印迹法观察成纤维细胞1 2 S M A 的表达情况；3 ) 制备成纤维细胞胶原凝胶并与上述同样损伤( L + M ) 处理的1 6 H B E 或同时添加B Q l 2 3 、T G F B1 中和抗体的1 6 H B E 共培养，测量各组凝胶直径变化以检测转分化的肌纤维母细胞的收缩反应及其上述处理因素的影响；4 ) 观察经共培养诱导转分化的上皮下成纤维细胞在损伤上皮细胞上清刺激下胞内钙离子( c a 2 + 】i ) 浓度的动态变化三、探讨损伤气道上皮细胞引起上皮下成纤维细胞活化、转分化的信号调节机制：1 ) 采用上述方法将L + M 损伤的1 6 H B E 与气道上皮下成纤维细胞共培养，或在共培养的同时分别加入p 3 8 、E R K I 2 和J N K 等丝裂原活化蛋白激酶( M A P K s ) 特异性抑制剂，观察它们对损伤1 6 H B E 作用下成纤维细胞n S M A表达以及胶原收缩的影响；2 ) 应用免疫印迹法检测与损伤上皮共培养的上皮下成纤维细胞磷酸化M A P K s 蛋白的表达水平、基因芯片检测损伤上皮对上皮下成纤维细胞M A P K s家族成员基因表达的影响；3 ) 将外源性E T 1 作用于成纤维细胞，观察细胞- S M A 表达及M A P K s 通路活化的情况；应用p 3 8M A P K 或E R K l 2 抑制剂观察它们对E T - 1 诱导的成纤维细胞a S M A 表达的抑制效果 四、分析E T 1 与M M P 29 的相互作用关系，探讨其在气道炎症与重塑中的可能地位：1 ) 观察M M P 9 真核表达质粒转染的1 6 H B E 培养上清中E T 1 的释放水平；中文摘要2 ) 应用Z y m o g r a p h y 法( 酶谱法) 分析机械划伤的稳定转化a n t i E C E 、p E G F P N 2 质粒及瞬时转染M M P 9 质粒的1 6 H B E 培养上清中M M P 9 的活性：3 ) 1 6 H B E 予L + M 损伤或同时加入M M P 2 抑制剂，检测培养上清中E T 1水平和M M P 一2 活性；4 ) 将a n t i E C E 质粒转染1 6 H B E 并与气道成纤维细胞共培养，分析上皮细 胞E T 1 、M M P 29 的表达情况及对成纤维细胞M M P 一2 活性的影响结果：一、损伤气道上皮E T 1 的释放、损伤上皮对上皮下成纤维细胞E T 1 生成的调节及E T 一1 对成纤维细胞 C a 2 + i 的影响：1 ) L + M 损伤的1 6 H B E 上清E T 一1 的水平 ( 4 9 2 1 0 6 ) p g m i 较正常对照 ( 2 6 9 0 1 8 ) p m l 】或单纯机械损伤 ( 2 9 4 0 5 6 ) p g m 1 明增加( p 0 0 5 ) 】：三、损伤上皮对上皮下成纤维细胞n S M A 表达的诱导作用及其转化的肌纤维母细胞的收缩反应变化：1 ) 与正常1 6 H B E 共培养组比，L + M 损伤1 6 H B E 共培养的上皮下成纤维细胞n S M A 表达增加、对胶原凝胶的收缩能力明显增强f 凝胶收缩百分比：【( 5 2 8 5 ：t ：7 8 7 ) V S ( 9 6 7 + 9 5 9 ) 】( p O 0 5 ) 3 T h ee f f e c t so fi n j u r e da i r w a ye p i t h e l i a lc e l l so nt h ei n d u c t i o no f 一S M Ae x p r e s s i o nr e l a t e dt oc o n t r a c t i l i t yi ns u b e p i t h e l i a lf i b r o b l a s t s ，a n dc o n c o m i t a n tc h a n g e so f i n t r a c e l l u l a rc a l c i u m ：1 ) I n j u r e d1 6 H B Ei n d u c e d - S M Ae x p r e s s i o ni nt h es u b - e p i t h e l i a lf i b r o b l a s t sa n ds i g n i f i c a n t l yr e i n f o r c e dt h ec o n t r a c t i l i t yo ft h ef i b r o b l a s t s r e l a t i v ec o n t r a c t i o np e r c e n t a g eo f ( 5 2 8 5 + 7 8 7 ) c o m p a r e dw i t ht h o s ec o c u l t u r e