中国人民解放军军事医学科学院 搏士后研究工作报告消减S E L E X 技术的建立Y8 王9 6 0 6E s t a b l i s h m e n to fS u b t r a c t 主v eS y s t e m a t 耋cE v o l I l t i o o fL i g a n d s b yE x p o n e n t i a lE n r i c h m e n tM e t h O d博士后姓名+ 合作导师姓名：玉成龙 王会信研究员 邵宁生副研究员 流动站f 一级掌科1 名称：生物掌 专业( 二级学科) 名称：生物化学与分子生物掌 研究工作起始时间：2 0 0 0 年0 9 月 研究工作期满时间：2 0 0 2 年1 2 月中国人民解放军军事医学科掌院 基础医掌研究所( 北京)2 0 0 2 年1 2 月中国人民解放军军事睚学科学院博士后研究工作报告缩略语缩略语英文全称A pb pB S Ac D N AD M S Od s D N AD T TE BE D l AF B SF 1 T Ch rl P T Gk DL Bm l nN G FP A G EP B SP C Rr ，mS D SS E L E Xs s D N AT E M E DX 唱a l缩略语a m p i c 川i nb a s ep a i rb o v i n es e r u ma l b u m i nc o m p l e m e n t a r yD N Ad i m e t h y ls u l f o x i d ed o u b l e s t m n d e dD N Ad i t h i o t h r e i t o Je t h i d i u mb r o m i d ee t h y I e n ed i a m i n et e t 船c e t i ca c i df b t a Ib o v i n es e r u mf I u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a th o u ri s o p r o p y l t l l i o - p g a l a c t o s i d ek i I o d a l t o nL u r i a B e r t a n im e d i u mm i n u t en e r v eg r o 、v t hf a c t o rp o l y a c r y l 啪i d eg e le l e 们p h o r e s i sp h o s p h a t e _ b u 腩r e d 鞠l i n ep o l y m e r a s ec h a i nr 髓c t i o nr e v o 】u t i o n sp e rm i n u t es o d i u md o d e c y l 锄l f a t es y s t e m a t i ce v 0 1 u t i o no fl i g 粕d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m e n ts i n g l es t 删n d e dD N At e t r a m e t h y le m y I e n ed i a m i n e5 - b r o m i d e - 4 c h l o r o 一3 i n d o l B D- g a l a c t o s i d e中文全称氨卞青霉索碱基对牛血清白蛋白互补D N A二甲基亚砜双链D N A二硫苏糖醇溴化乙锭乙二胺四乙酸胎牛血清异硫氰酸荧光素小时异丙基硫代一D - D - 半乳糖苷千道尔顿L B 培养基分钟神经生长因予聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液多聚酶链式反应每分钟转速十二烷基硫酸钠配体指数级富集系统进化单链D N A四甲基乙二胺5 - 溴4 一氯- 3 吲哚- B D半乳糖苷中团人民解放军军事医学科学院博士后研究工作报告中文摘要消减S E L E x 技术的建立博士后于成龙合作导师王会信邵宁生军事医学科学院基础医学研究所1 0 0 8 5 0摘要恶性肿瘤是目前人类死亡的主要原因之一。人类对肿瘤的早期诊断和有效治疗缺乏特异性是恶性肿瘤对人类生存产生巨大威胁的主要原因。目前所发现并用于早期临床诊断的肿瘤标志物与正常细胞相比还没有质的区别，只是量的不同，缺乏真正的特异性；手术切除、放疗和化疗的联合应用是目前临床上治疗肿瘤的主要手段，虽然手术切除是去除实体瘤组织的有效方法，但在切除肿瘤组织的同时把一部分正常组织也扩大切除了，对人体创伤大，并且还有复发和转移的危险，术后仍需放疗和化疗但是，不论是放射性同位索还是化疗药物对于肿瘤细胞和正常细胞都不加区分的一起杀死，因此在治疗肿瘤的同时也对人体造成了极大的损害，并且由于不能使用较大剂量而严重影响放疗和化疗的效果。当前恶性肿瘤早期诊断和有效治疗方面存在的诸多不利因素的一个根本原因是人们对正常细胞和恶性肿瘤细胞之间差异的理解缺乏足够的知识。S E L E x ( S y s t c m a t ce v o l u t i o no fl i g a I l d sb ye x p o n e n t i a le n r i c h m 明t ) 技术是2 0世纪9 0 年代发展起来的一种生物文库技术，该技术的目的就是利用人工合成的随机寡核苷酸文库筛选某一靶分子的特异寡核苷酸配基。由于S E L E x 技术具有可筛选的靶分子范围非常广，理论上能筛选已知的所有分子；筛选得到的配基亲合力和特异性极强，远高于其他任何类型的配基：操作简便，筛选周期短等优点，s E L E x 技术在临床诊断和疾病治疗方面具有广阔的应用前景。本研究将消减杂交的原理引入S E u 筛选，分别以分化前后P c l 2 细胞为消减靶子和筛选靶子，建立消减s E L E x 技术，并筛选获得特异识别已分化P c l 2细胞而不识别未分化P C I 2 细胞的单链D N A ( s i n g l es t r a l l d e dD N A ，s s D N A ) 配基。期望能够为临床肿瘤诊断和治疗提供新的、实用的技术方法。为了建立以完整细胞为靶子的消减S E L E x 技术，我们首先建立以单一蛋白为靶子，用随机s s D N A 文库进行s E L E x 筛选的方法。为建立以完憨细胞为靶子的消减s E L E x 技术提供技术准备。研究结果表明：同样大小的s s D N A 和双链D N A ( d o u b l e s t 啪d e dD 1 q A ，d S D N A ) 在7 M 尿素1 2 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中国 民解敞军军事医学科学院博士后研究工作撤告中文摘要( p o l y a c r y I a m i d eg e le l e t m p h o r e s i s ，P A G E ) 中的电泳行为不同，s s D N A 由于形成较为复杂的空间结构，泳动速度比d s D N A 慢。我们利用这一特点，以不对称p c R ( p o l y m e r a c h a i n 糟a c i o n ，P c R ) 方法首先扩增制餐了s 囝N A 文痒。逮遭对人工合成随机s s D N A 文库进行D N A 序列测定证实，实验所用的随机s s D N A 文库的随机度是好的，能够保证s E L E x 筛选所需要的库容量。在此基础上，我们以商品他的、识被在磁珠表顽的链霉亲合索为靶子，用髓机s s D N A 文痒筛选特异识别链霉亲合索的s s D N A 配基，经过1 2 轮筛选，流武细胞术检测发现特异配蘩已被富集。配基D N A 序列测定后，核瞥酸序列二级结构分析得到共有的单茎环结构。生物素与磁珠作用后，封闭了配蒸与包被在磁珠表面的链霉亲台素的结合位点，第1 2 轮筛选s s D N A 文痒不再与磁珠结会，劳基配基竞争揶铡生物素与链霉亲合素的结合，证实富集的文库是特异识别链霉亲含索的s s D l A 配基。以上检测所用配基是异硫氰酸荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y 黼a t ，F I T C ) 标记配基，可用流式细胞仪检测结合在磁珠表面的F l T C 标记配基的擞，结合在磁球表面的F l T C标记配基的豢越大，荧光强度僮越丈，强形右移越瞻箍。隧上，我们遥过对包被在磁珠表面的链霉亲合素用随机s s D N A 文库进行的S E L E x 筛选，建立了s s D N A文库S E L E x 方法。用固定他的单一蛋自为靶子进行s E L 嚣X 筛选，搡俦相对箍蠖。在已建立的s s D N A 文库S E L E X 方法纂础上，我们以已分化和束分化P c l 2 细胞为模型建立了以完整细胞为靶子的消减s E L E x 技术。首先培养P c l 2 细胞并用神经生长因子( n e r v eg r o 眦hf h c t o r N G F ) 诱导分化，获取已分化和来分化P c l 2 细胞，分别作为港减靶子饔筛选靶子；然藩先将来分化P c l 2 细愆与随机s s D N A 文库共同孵育，以去除识别来分化P c l 2 细胞与已分化P c l 2 细胞共有成分的s s D N A 配基，对文库进行消减，再将消减文库与已分化p c l 2 细胞共同孵育，对文库进行筛选，洗去不与已分化P e l 2 细胞结合的s s D N A 文库，P c R 扩增与已分化P C I 2 纲胞结合的s s D N A 文库，不对称P C R 扩增并切胶纯亿制各s s D N A 文库用予下一轮筛选。经过6 轮消减S E L E x 筛选，放射性同使素和流式细胞术检测发现：随着筛选轮次的增加，s 戏I N A 文库逐渐富集，富集的蚓) N A 配基特异识别完整已分化P c l 2细胞，菰不识爨未分纯P C I 2 细腱：测定并分耩塞集驰配基D N A 序列发瑗这些配基可能为G 四聚体结构。用流式细胞术检测发现：2 3 个单一序列配基均与已分化P C I 2 细胞具有较强的结合，而与朱分化P C I 2 细胞不结合，其中配基1 7 与已分化P c l 2 细胞的结合最强。用配基1 7 对两秘细胞等比例混合物进行沆式细胞术检测，出现了两个峰，一个峰是与未分亿P C 2 细麓结合的峰，勇一个峰是与中国人民解放军军事医学科学院博士后研究工作报告中文摘要已分化P c l 2 细胞结合的峰，说明筛选得到的单一序列配基能够特异识别混合物中已分化P C I 2 细胞。为了进一步研究经过消减s E L E x 筛选得到的高亲合力配基的结构与功能，我们对用消减s E L E x 技术筛选到的、与已分化P C I 2 细胞结合最强的配基1 7 进行了改造，将配基1 7 两端的固定序列部分或全部截去，保留中间的随机序列，使得配基的长度分别减小到2 5b p ( A P l 7 2 5 ) 、3 8 b p ( A P l 7 - 3 8 ) 和4 8 b p ( A P l 7 4 8 ) ，流式细胞术和荧光显微镜检测证实，改造后的A P l 7 2 5 、A P l 7 3 8 和A P l 7 4 8 仍能特异识别完整已分化P c l 2 细胞，而不识别未分化P c l 2 细胞：A P l 7 3 8 也能够从两种细胞混合物中特异识别出已分化P c l 2 细胞。激光共聚焦显微镜观察发现：A P l 7 3 8 结合在已分化P C I 2 细胞的胞浆内。总之，我们以包被在磁珠表面的链霉亲合素为靶子，建立了s s D N A 文库s E L E x 方法，并检测了实验所用随机s s D N A 文库的随机度、建立了s s D N A 文库的制备方法，同时证实了使用F l T c